ANIMALES TRANSGENICOS

¿Cómo fabricar una proteína humana? Por ejemplo: la insulina se usa para tratar la diabetes. Como podemos producir toda la insulina que se necesita para tratar a 400 millones de pacientes en el mundo?

Con una BACTERIA

Con una Levadura

Con una Célula

PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA

Animales Transgénicos Plásmido (vector de ADN) Plásmido pCX-EGFP

Animales transgénicos Otros sistemas Plantas transgénicas Animales transgénicos

“Vacas que expresan insulina en la leche” Gen de la Insulina “Vacas que expresan insulina en la leche” (25 vacas para demanda mundial) ADN humano Ovulo de vaca Introducción

Direccionamos la expresión!!! Animales Transgénicos Promotor de las glándulas mamarias ¿Cómo? Gen de la Insulina Direccionamos la expresión!!!

Transgénesis por retrovirus recombinantes Transgénesis por microinyección de pronúcleos Transgénesis por clonación Transgénesis mediada por espermatozoides

Transgénesis por retrovirus recombinantes

Ventajas -No se requiere visualización del pronúcleo ni usar equipamiento complejo -Menos invasivo -Mayor eficiencia de la transgénesis (50-70%) Desventajas -Mosaicismo -Inserción al azar -Bajo nivel de expresión -Transgén no mayor a 10kb

Transgénesis por microinyección de pronúcleos

Recolección de los ovocitos Obtención de ovocitos a partir de animales sacrificados para consumo - Progreso genético mínimo - Garantía sanitaria escasa - Uso en Investigación Lavado de ovarios Aspiración de los folículos antrales Complejos cúmulus-ovocito Los ovarios obtenidos en el matadero se lavan con solución fisiológica estéril a 30ºC. Luego, se punzan los folículos de entre 2 y 8 mm de diámetro y se aspira el fluido folicular por presión negativa con jeringas de 5 o 10 mL. Finalmente, se buscan los ovocitos bajo lupa estreoscópica y se seleccionan aquellos que poseen un cúmulus de células compacto y un citoplasma homogéneo. Así, se obtienen ovocitos inmaduros en estadio de vesícula germinal. La transparencia muestra el procedimiento seguido para la aspiración de folículos antrales. Referencias: http://www.wisc.edu/ansci_repro/lab/lab11/lab11images.html

Animales Transgénicos Cultivo in vitro =

Animales Transgénicos Equipo de laboratorio Microagujas

Transgénicos por microinyección de pronúcleos Gordon et al., 1980 (PNAS)

Transgénesis por microinyección de pronúcleos (+) -Ampliamente usada (-) Mosaicismo Baja eficiencia (0,003 % Bovino) Inserción del transgén al azar Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Gordon y col., 1980 (PNAS)

Transgénesis por clonación

Clonación oveja Dolly Wilmut et al., 1997 Nature 385,810–813. Introducción Clonación oveja Dolly Wilmut et al., 1997 Nature 385,810–813.

278 days Cloned calf Tissue culture Fetal cells oocyte 75 Day Fetus FIBROBLAST EXTRACCION DE NUCLEO Enucleated oocyte Cloned calf FUSIÓN CELULAR 7 Days embryo OVULO ACTIVADO CON NUCLEO DE FIBROBLASTO 278 days Embryo transfer Recipient cow 23

PASOS DE LA CLONACIÓN ENUCLEACIÓN Fotos Cyagra

TRANSFERENCIA NUCLEAR PASOS DE LA CLONACIÓN TRANSFERENCIA NUCLEAR Fotos Cyagra

Transgénesis por clonación (SCNT ) (+) -Ampliamente usada -Identificar integración del transgén in vitro (-) -Impronta -Eficiencia 1-3% Inserción del transgén al azar Consumo de tiempo Cibelli y col., 1998 (Science) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

TRANSGENESIS MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES Además del ADN paterno (función natural), el espermatozoide lleva ADN exógeno

espermatozoide llevando el gen exógeno al interior del ovocito Animales Transgénicos ESQUEMA DE LA TECNICA espermatozoide llevando el gen exógeno al interior del ovocito Espermatozoide Gen exógeno Ovocito

Incubación espermatozoides/plásmidos Coincubación Espermatozoides Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

Transgénesis por Espermatozoides ICSI Pipeta de holding Espermatozoide 1er. CP

Transgénesis por Espermatozoides ICSI Lugar de deposición

Transgénesis por Espermatozoides ICSI Sin espermatozoide

Transgénesis mediada por espermatozoides (+) -Sencilla -Alta eficiencia (-) -No ha sido usada en rumiantes -Inserción del transgén al azar -Mosaicismo en embriones Brinster y col., 1981 (PNAS) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

Núcleo espermático color rojo (IP) Microscopía confocal Núcleo espermático color rojo (IP) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Plásmido marcado color verde (FITC) (1000x)

Microscopía confocal de ovocito inyectado Espermatozoide con ADN exógeno qPCR Núcleo ovocito Ovocito Copias del plásmido Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA 3x105 moléculas por espermatozoide. (400x)

91% GFP tratamiento corto y 66% GFP tratamiento largo.

Cerdos 60% Gatos 26% Vacas 23% Caballos 29% (R. Olivera) Gatos 26% (Med Vet J. Jarazo) Vacas 23% Caballos 29% Mosaicismo 20-60%

Modificación genética a realizar Cutícula (cutina) Sintetizar el gen de la cutinasa con un promotor de glándulas salivales Transferirlo a una Oveja para que exprese cutinasa en saliva y aproveche mejor la oferta forrajera Hongo fitopatógeno Fusarium solani CUTINASA

Dinastía ESPERANZA Esperanza 1 (25/04/08) Esperanza 2 (04/08/09) Negativos para el transgén por PCR y Southern blot. Confirmación de paternidad por microsatélites.

Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

Bovinos resistentes a la “vaca loca” Ganadería RositaIsa Leche humanizada de vaca INTA Balcarce y Univ. de San Martín Bovinos resistentes a la “vaca loca” Richt y col., 2006.

Transgénicos por Clonación

Medicamento producido por animales transgénicos autorizado por la FDA. GTC Biotherapeutics, Massachusetts.

Producción de órganos para xenotransplante: - Producción cerdos que expresan proteínas humanas que bloquean la acción del complemento (ej. CD59). - Transplantes de corazón o hígado en forma temporaria hasta la obtención de donante compatible.

Ratones: Modelos de Enfermedades o para Investigaciones

Mutagénesis dirigida en células madre embrionaria Animales knock-in Animales knock-out Animales knock-down

Animales knock-out condicionales: Sistema Cre-loxP

Animales Transgénicos Pasado Las Vacunas: Primer ejemplo de la utilidad de los animales de granja en la salud humana. 1796 Edward Jenner, descubre de la “vacuna” antivariólica. Viruela: Causante en el Siglo XVIII de 60 millones de muertes Siglo XX: En Mayo de 1980, la OMS declara oficialmente la erradicación mundial de la viruela humana

Animales Transgénicos Presente Fermentador como bioreactor para producir vacunas y proteínas recombinantes para la salud humana

Futuro Animales Transgénicos Siempre se escuchan las voces de los detractores del desarrollo científico En el siglo XVIII y en oposición a la tecnología de Jenner, se dijo: “Existen informes fidedignos de niños que habían empezado a mugir y andar en cuatro patas y de gente con cuernos” por haber sido vacunados. La realidad demostró lo contrario, ¿hoy en el Siglo XXI, escuchamos comentarios similares?