INTRODUCCION A LA BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A INMUNOLOGIA

REACCION EN CADENA DE POLIMERASA

PCR: ANTECEDENTES HISTORICOS descubrió sustancia (acida y carga de P) que llamó "nucleina“(nucleoproteína) Aisló ADN (nucleina y protamina) de esperma de salmón 1869 Friedrich Miescher (1844-1895) Miescher era estudiante de medicina y en el laboratorio de Hoppe-Seyler, su maestro, comenzó a analizar los restos de pus de los desechos quirúrgicos, aislando los núcleos de los glóbulos blancos con alcohol caliente y una pepsina enzimatica y extrayendo una sustancia ácida y cargada de fósforo a la que denominó "nucleína" (hoy sabemos que esta sustancia es la nucleoproteína). se dedicó a aislar núcleos. Cuando trató los núcleos aislados con una solución alcalina y luego la acidifico, observó un precipitado. El análisis de este precipitado mostró que se trataba de un material complejo que contenía entre otras cosas, nitrógeno y fósforo. comenzó sus investigaciones con el esperma de los salmones, y descubrió la presencia de una serie de sustancias, una ácida (ácido nucléico o "nucleína") y una fuertemente básica, a la que denominó "protamina" y que se identifica con las histonas. En 1889 el patólogo alemán Richard Altmann, discípulo de Miescher, logró separar por vez primera las proteínas de la “nucleína”, llamando a la nueva sustancia "ácido nucleico". Descubrió que las nucleoproteínas contienen una parte protéica y otra no protéica y, precisamente en esta última (donde se encontraban los ácidos nucleicos), halló las bases heterocíclicas nitrogenadas de la adenina y la timina.  Phoebus Aaron Theodore Levene, M.D. (25 de febrero de 1869 – 6 de septiembre de 1940) fue un bioquímico ruso-estadounidense que estudió la estructura y función de los ácidos nucleicos. Él caracterizó las diferentes formas de ácidos nucleicos, ADN de ARN, y encontró que el ADN contenía adenina, guanina, timina, timidina, desoxirribosa, y un grupo fosfato   1889 Richard Altmann SEPARA LAS PP DE LA NUCLEINA ACIDO NUCLEICO 1919 ESTUDIO ESTRUCTURA DE ADN-ARN. 4 BASES NITROGENADAS PHOEBUS BASANDOSE EN INV DE KOSSEL

PCR: ANTECEDENTES HISTORICOS En la década de 1950, tres grupos hicieron SE PROPUSIERON DETERMINAR la estructura del ADN. El primer grupo COMENZO en el Kings College de Londres y fue dirigido por Maurice Wilkins y más tarde se unió a Rosalind Franklin. Otro grupo formado por WATSON Y CRICK en Cambridge. Un tercer grupo estaba en Caltech y fue dirigido por Linus Pauling. Crick y Watson construyeRON modelos físicos utilizando varillas y bolas de metal, en el que se incorporan las estructuras químicas conocidas de los nucleótidos, así como la posición conocida de los enlaces que unen un nucleótido a OTRO a lo largo del polímero. En el Kings College Maurice Wilkins y Rosalind Franklin examinaron los patrones de difracción de rayos X de las fibras de ADN. De los tres grupos, sólo el grupo de Londres fue capaz de producir patrones de difracción de buena calidad y por lo tanto producir datos cuantitativos suficientes sobre la estructura Pauling En el 1953, publico un artículo en el que proponía una estructura de triple-hélice para el ADN. Mientras que Watson y Crick trabajaban en esta estructura, pero estaba equivodaca ya que no tomaban en cuenta las aportaciones de franklin, ella había determinado el contenido hídrico del ADN por medio del uso de métodos cristalográficos usando los rayos X. Fue la famosa "fotografía 51" de Franklin la que, finalmente, reveló la estructura helicoidal del ADN a Watson y Crick en el 1953. Esta es una foto del ADN que ha sido cristalizado bajo condiciones húmedas en la que se discierne una X borrosa en medio de la molécula, un patrón indicativo de una estructura helicoidal. 1993 le fue concedido el Premio Nobel de Química a su inventor “oficial”, Kary B. Mullis, quien describió el proceso en 1985 y 1988. Sin embargo, catorce años antes (1971 y 1974), el Dr. Molineux, del grupo de Khorana, describió la misma técnica con exquisito detalle, aunque, lamentablemente, consideraron que dicha metodología no era funcional Kings College Londres Linus Paulin CALTECH Cambridge ESTRUCTURA DE 3 HELICE PCR 1985-1988 PREMIO NOBEL DE QUIMICA 1993

18-30 nucleótidos C-G 55% DIMEROS PCR TECNICA ENZIMATICA IN VITRO USADA PARA AMPLIFICAR REGION DETERMINADA DE ADN, CUYA SECUENCIA SE CONOCE PCR ES UNA TECNICA ENZIMATICA IN VITRO USADA PARA AMPLIFICAR EXPONENCIALMENTE UNA REGION DETERMINADA DE ADN SITUADA ENTRE DOS REGIONES DE ADN, CUYA SECUENCIA SE CONOCE. PARA LO CUAL SE REQUIERE: MOLDE A PARTIR DEL CUAL SE GENERARAN LAS COPIAS OLIGONUCLEOTIDOS cortos de 18 a 30 nucleotidos (CEBADORESO PRIMERS) ESPECIFICOS COMPLEMENTARIOS A UNA PORCION DE LA REGION QUE SE DESEA AMPLIFICAR. Se utilizan dos cebadores por reaccion uno para cada cadena de ADN. DELIMITANDO LA REGION QUE SE DESEA AMPLIFICAR ENZIMA CAPAZ DE SINTETIZAR ADN UTILIZANDO COMO MOLDE ADN. ADN POLIMERASA O ARN POLIMERASA DEPENDIENTE DE ARN EN CASO DE PCR DE TRANSCRIPCION REVERSA DESOXINUCLOTIDOS QUE SERAN INCORPORADOS A LAS CADENAS NACIENTES RESULTADO SON VARIOS FRAGMENTOS DE COPIAS DE ADN COMPRENDIDO ENTRE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ESPECIFICOS ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa,4 que proviene de una bacteria termófi la llamada Thermus aquaticus, la cual vive en condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar ese tipo de temperaturas. El rasgo que distingue a esta enzima bacteriana de otras ADN polimerasas de otros organismos es su capacidad para mantener su funcionalidad a temperaturas altas, por lo que se le considera una enzima termoestable. También hay otras enzimas que se utilizan como la Vent, obtenida de la bacteria Thermococcus litoralis.5 Normalmente, casi todas las enzimas que se venden comercialmente son efi cientes y generalmente cuando fallan lo hacen una manipulación incorrecta del usuario Para que la enzima funcione con alta especifi cidad y la reacción transcurra exitosamente, también se necesita de los elementos ya mencionados como primers, dNTPs, Mg +, buffer y H2O. En el desarrollo de la técnica, la enzima utilizada era una polimerasa aislada de E.coli (fragmento Klenow de la ADN polimerasa I), que presenta su actividad óptima a 37 oC, y se inactiva a 94 oC, es por ello que en cada ciclo era necesario agregar más enzima. Luego, se sustituyó por una polimerasa termoestable aislada de Thermus aquaticus (Taq), una bacteria termófila que vive en la proximidad de las fuentes de agua termal (entre 50 y 80 oC), es por esto que su enzimapolimerasa es más estable, y permite soportar las temperaturas elevadas durante los ciclos de la PCR. Los primers son secuencias de oligonucleótidos que fl anquean y delimitan la secuencia blanco que se desea amplifi car y son complementarios a ésta. Generalmente su tamaño oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia. Si no se respetan estas reglas, existe la posibilidad de la formación de dímeros de primers, es decir, de productos inespecífi cos. Esto repercutiría en el rendimiento de la reacción, así como en la especifi cidad del producto esperado. Son dos secuencias diferentes de primers las que se utilizan en la PCR, una denominada «forward» o sentido y otra «reward» o antisentido; ambas deben estar diseñadas para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq polimerasa en dirección 5’-3 (como sucede endógenamente). Con dNTP’s son los ladrillos o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores importantes que contribuyen a la especifi cidad de la reacción, por ello es importante que su concentración sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la función de la Taq polimerasa. El buffer es la solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está compuesta de Tris-HCL (HIDROXIMETIL AMINOMETANO MAS ACIDO CLOTHIDRICO(pH = 8) cuya concentración fi nal de trabajo debe ser 1X. El magnesio es un cofactor enzimático que infl uye en la especifi cidad de la reacción, por eso se debe tener una concentración adecuada para que no afecte el rendimiento de la Taq polimerasa; regularmente su concentración oscila entre 0.5 y 2.5 mM. En ocasiones ya viene incluido en el buffer, pero en otras se le tiene que agregar. El agua es el disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada libre de nucleasas, enzimas que degradan a los ácidos nucleicos. MOLDE OLIGONUCLEOTIDOS/ PRIMERS (F-R) 18-30 nucleótidos C-G 55% DIMEROS ADN/ARN POLIMERASA Termus aquaticus Klenow E. coli dNTPs (A,T,C,G) Mg +, H2O, buffer

PCR ADN El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza química ofrece ventajas para su manipulación. Para entrar en contexto, es importante recordar que la molécula de ADN está formada por tres componentes: un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, timina, guanina o citosina) que es complementaria con la base de otra cadena (Figura 1), de tal forma, que el ADN se estructura en una doble hélice.3 La complementariedad entre las bases está dada por puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas, generando estabilidad a la doble hélice, la carga eléctrica del ADN es negativa y está dada por los grupos fosfatos. DESOXIRRIBOSA

PCR DESNATURALIZACION: CADENAS SEPARADAS 95°C X 30 SEG tiempo depende de cantidad de GC tres enlaces de H Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario más tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces, uno más que las bases de A-T. Además, depende de la velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al modelo del equipo. Al fi nal de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como templado para el siguiente paso. Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especifi cidad del complejo será efi ciente. Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al fi nal del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador. Típicamente, una reacción convencional utiliza 35 ciclos, siendo cada etapa de desnaturalización, anillado y extensión de 30 segundos. El tiempo de extensión también varía de acuerdo al tamaño del fragmento que se desea amplificar y la velocidad de la enzima con la cual estamos realizando la reacción. Cuando los fragmentos que se desea amplificar son mayores a 5000 bases, la extensión puede necesitar de 5 a 10 minutos. HIBRIDACIÓN: PRIMER SE ALINEAN AL EXTREMO 3’ E HIBRIDAN CON SU SECUENCIA COMPLEMENTARIO . Tm Tm EXTENSION: ACTÚA LA TAQ POLIMERASA SOBRE EL COMPLEJO HEBRA DE ADN-PRIMER AGREGA dNTP´s complementarios para la nueva cadena Típicamente, una reacción convencional utiliza 35 ciclos, siendo cada etapa de desnaturalización, anillado y extensión de 30 segundos.

CONTAMINACION AREA PRE-PCR: juego de pipetas zona UV para descontaminación, realización mezclas de reacción (el tampón de reacción, la enzima, los dNTPs, el agua y los cebadores FLUJO UNIDIRECCIONAL En primer lugar, lo ideal es trabajar en tres áreas diferentes, separadas en lo posible físicamente, y a las cuales se debe acceder siguiendo un camino en el cual una vez llegada a la última área no es posible volver atrás (flujo uni‐direccional). La primera de las áreas, con su juego de pipetas exclusivo y zona UV para descontaminación, es para la realización de las mezclas de reacción (en esta área sólo debemos hacer la mezcla que incluye el tampón de reacción, la enzima, los dNTPs, el agua y los cebadores), esta área en general es conocida como área de pre‐PCR. vez finalizada esta etapa, donde se preparan la cantidad de reacciones necesarias para el trabajo, se pasa a la siguiente área, dónde únicamente se agregara tubo a tubo el ADN molde (área PCR). Siempre, debemos incluir un tubo blanco de reacción que debe tener todos los componentes de la mezcla excepto el molde, que sustituiremos con agua. Idealmente se pueden realizar 2 blancos, uno que cerraremos en el área de pre‐PCR, que permite detectar si hay contaminación de los reactivos, y otro que dejaremos abierto durante toda la manipulación para asegurar que no hubo contaminación durante la misma. También, en el caso de contar con un control positivo, la incorporación del mismo en cada tanda de reacciones es recomendable. Por último se pasa al termociclador (ver apartado: Termocicladores) y a la visualización de los fragmentos amplificados E sta última área es conocida como área de post‐PCR. De acuerdo al flujo uni‐direccional, estos tubos nunca DEBEN pasar al área de pre‐PCR. Se recomienda trabajar con túnicas diferentes en cada área. Idealmente, también se puede hacer uso de presiones diferenciales en las diferentes salas para minimizar los problemas de contaminación. Como veremos más adelante, la aparición de la PCR en tiempo real, minimizó uno de los mayores problemas de contaminación al evitar la apertura de los tubos una vez finalizada la reacción (principal fuente de contaminación de reacciones). Termocicladores: En los comienzos de la técnica no existían equipos de PCR automatizados, por lo cual se utilizaban diferentes baños termostatizados (a las temperaturas de desnaturalización, anillado y extensión) y manualmente se cambiaban los tubos de un baño a otro. El primer equipo desarrollado, de hecho, únicamente automatizó el cambio manual de tubos. Los equipos actuales constan, básicamente, de un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado rápidamente (generalmente mediante el sistema peltier), con posibilidad de programar las temperaturas, rampas de subida y bajada de las mismas y los tiempos de cada etapa de los ciclos, así como la cantidad de ciclos. En general presentan una tapa térmica que evita la evaporación de la mezcla de reacción durante la etapa de desnaturalización. AREA PCR: SE AGRAGA EL ADN MOLDE SE INCLUYE TUBO BLANCO ( TODO MENOS EL MOLDE) Y POST-PCR: TERMOCICLADOR

VISUALIZACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR BROMURO DE ETIDIO AGAROSA ELECTROFORESIS El procedimiento más común para el análisis de los fragmentos obtenidos en la PCR es la electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida. La electroforesis permite separar fragmentos de acuerdo a su tamaño. Los fragmentos de ADN (cargados negativamente) se desplazan por el gel a través de un campo eléctrico hacia el polo positivo. Los fragmentos más pequeños migran más rápido y son los que vemos más abajo en el gel. La elección de la matriz (agarosa o acrilamida) y el porcentaje en la cual separar los productos, dependerá del tamaño de los mismos y los largos diferentes que deseemos separar. Generalmente, los geles de agarosa se visualizan agregando Bromuro de etidio, un agente que se intercala en el ADN y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV, y en el caso de los geles de acrilamida, la tinción se realiza con nitrato de plata, que por interacciones electrostáticas se une al ADN. EJEMPLO: Gel de agarosa 1 % teñido con bromuro de Etidio dónde se visualizan productos de amplificación de diferentes tamaños (carriles 1, 2, 3 y 7) entre 250 y 500 bases. En los carriles 3 a 6, el tamaño parece ser el mismo. Sin embargo, la resolución de este tipo de gel no hace posible esta afirmación. ACRILAMIDA NITRATO DE PLATA Gel de agarosa 1 % teñido con bromuro de Etidio se visualizan productos de amplificación de diferentes tamaños (carriles 1, 2, 3 y 7) entre 250 y 500 bases. En los carriles 3 a 6, el tamaño parece ser el mismo. La resolución de este tipo de gel no hace posible su confirmación .

TRANSCRIPTASA REVERSA (polimerasa ADN-ARN dependiente) VARIANTES DE PCR TRANSCRIPTASA REVERSA (polimerasa ADN-ARN dependiente) RT-PCR ARN MOLDE PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería: 1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN. UNION DEL PRIMER A LA SECUENCIA DE ARN OBJETIVO Y EXTENSION DEL PRIMER MEDIANTE LA ADICION DE NUCLEOTIDOS COMPLEMETARIOS 2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc. 3.er paso: PCR estándar. DADO QUE EL ARN ES DE UNA SOLA HEBRA Y SENSIBLE AL CALOR ES NECESARIO HACER UNA TRANSCRIPCION REVERSA ANTES DE INICIAR LA AMPLIFICACION POR PCR. LA TR GENERA UNA COPIA DE LA HEBRA DE ARN PERO ESTA COPIA ES ADN COMPLEMENTARIA ADNC EL CUAL ES ESTABLE AL CALOR Y RESISTE LA PCR El ADNc se desnaturaliza a mas de 90ºC (~94ºC), las dos hebras se separan. A 50 o 60ºC los primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de unión a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a 100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real A 72°C la polimerasa extiende el DNA desde los primers. Se obtienen 4 cadenas de ADNc. Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de ADNc, los productos de reacción son analizados usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de etidio. Los geles de agarosa para analizar los productos de ADNc de la RT-PCR no nos permiten la cuantificación ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda es perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación. El bromuro de etidio es un colorante que se une a la doble cadena de ADN intercalándose entre los pares de bases. Emite luz fluorescente cuando se irradia en la parte UV del espectro. Sin embargo, la fluorescencia no es muy brillante. Otros colorantes, como el SYBR green, que son mucho más fluorescentes que el bromuro de etidio, se utilizan en el PCR en tiempo real. Sensible al calor No permite la cuantificación Bromuro de Etidio mas UV

VARIANTES DE PCR PCR ANIDADA: ALTA S Y E EL PRODUCTO DE UNA AMPLIICACION ES UTILIZADO COMO MOLDE PARA REALIZAR UNA SEGUNDA AMPLIFICACION CON INICIADORES QUE SE UBICAN DENTRO DE LA PRIMERA SECUENCIA AMPLIFICADA. PCR ANIDADA: EL PRODUCTO DE UNA AMPLIICACION ES UTILIZADO COMO MOLDE PARA REALIZAR UNA SEGUNDA AMPLIFICACION CON INICIADORES QUE SE UBICAN DENTRO DE LA PRIMERA SECUENCIA AMPLIFICADA. ES ALTAMENTE ESPECIFICA PCR anidada o nested: Se trata de una técnica que aumenta la sensibilidad de la PCR. En este caso se trabaja con 4 cebadores, en una primera ronda se amplifica de manera convencional con los dos cebadores más externos a la región que se desea amplificar. El producto de este primer PCR se utiliza como molde para una segunda ronda que utiliza cebadores internos a la región previamente amplificada. La desventaja de esta técnica es la posibilidad aumentada de contaminación, y además no permite cuantificar la cantidad inicial de ADN molde presenta en la muestra analizada. TIENE LA VENTAJA DE BRINDAR ALTA SENSIBILIDA Y ESPECIFICIDAD . LA ESPECIFICIDAD AUMENTA PORQUE COMO ES UN AMPLICON DE UNA AMPLIFICACION OBTENIDO PREVIAMENTE, LOS CEBADORES SOLO VAN A HIBRIDAR EN UN SITIO DENTRO DE LA MOLECULA Y EL RESULTADO SERA UNA UNICA BANDA. ASI EVITAMOS HIBRIDACIONES INESPECIFICAS DE CEBADORES LA DESVENTAJA ES QUE NO PERMITE CUANTIFICAR LA MUESTRA LOS CEBADORES SOLO VAN A HIBRIDAR EN UN SITIO DENTRO DE LA MOLECULA Y EL RESULTADO SERA UNA UNICA BANDA. ASI EVITAMOS HIBRIDACIONES INESPECIFICAS DE CEBADORES

VARIANTES DE PCR PCR in situ PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde Los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación. La PCR in situ: en secciones histológicas o células, los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación, sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. Se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN complementario a la secuencia diana. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de ADN.

VARIANTES DE PCR PCR MULTIPLEX VENTAJAS: Se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo PCR MULTIPLE en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN. Ventajas: información sobre varios locus en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización del proceso. VENTAJAS: - Información sobre varios locus en una sola reacción - Menor cantidad de molde para el análisis Menor cantidad de reactivos DESVENTAJA: cuidadosa optimización del proceso. -IDENTIFICACION PATOGENOS -GENOTIPIFICACION DE SNP -ANALISIS DE DELECION -DETECCION DE ARN USOS

PCR TIEMPO REAL Resuelve problema de la cuantificación de la técnica de la PCR, se emplean sondas marcadas con fluorocromos. > S < FN ESPECIFICO PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR) Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature). La PCR en tiempo real (o PCR cuantitativa) surgió para resolver el problema de la cuantificación de la técnica de la PCR. En la PCR en tiempo real se emplean sondas marcadas con fluorocromos. Las sondas de hidrólisis, frecuentemente empleadas en esta técnica, son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de ADN que se quiere amplificar. Uno de los fluorocromos actúa como donador de fluorescencia en el extremo 5’ y el otro como aceptor de esta fluorescencia en el extremo 3’. La ADN polimerasa se desplaza sobre la cadena de ADN sintetizando la cadena complementaria a partir de un fragmento de ADN que sirve de molde (cebador). Al llegar al punto en el que la sonda se ha hibridado, la hidroliza. El fluorocromo del extremo 5’ de la sonda (el donador) es liberado. El fluorocromo aceptor no puede entonces absorber la fluorescencia del donador por estar alejado de él espacialmente. Un detector realiza la medida de esta emisión de fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de ADN presente, y la representa gráficamente. Además de proporcionar información cuantitativa, la PCR en tiempo real presenta otra serie de ventajas frente a la PCR tradicional. La fundamental es su mayor sensibilidad lo que disminuye el riesgo de falsos negativos. El hecho de que los datos sean tomados en la fase exponencial del proceso asegura que ningún componente pueda estar limitando el proceso de amplificación. También es más rápida y tiene menos probabilidad de contaminación con lo que disminuyen los falsos positivos. Son muchas las aplicaciones de esta técnica en el campo de la medicina. Cabe destacar la cuantificación viral, la cuantificación de la expresión de genes, el control de la eficacia de fármacos, la detección de agentes infecciosos, el diagnóstico de tumores y la detección de polimorfismos. : NO ESPECIFICOS; se basan en el uso de moléculas intercalantes que tienen afi nidad por el ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan una señal fl uorescente. La fl uorescencia emitida es capturada en la etapa de extensión de cada ciclo y es proporcional al número de copias de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR. El reportero más usado para estos fi nes se llama SYBR Green la cual es una molécula cargada positivamente que, mientras esté en solución sin unirse al ADN de doble cadena, prácticamente no emite fl uorescencia; sin embargo, cuando se une al surco menor del ADN incrementa hasta 1,000 veces su fl uorescencia Aunque el SBYR Green es uno de los reporteros fl uorescentes más utilizados por los investigadores debido a su bajo costo, la principal desventaja es que puede unirse a cualquier molécula de ADN de doble cadena, incluyendo dímeros de primers. Muchos laboratorios, para evitar esta situación, optimizan sus reacciones realizando una «curva melting» o «curva de disociación» al fi nal de la reacción, cuya función es la de evaluar si se formó un producto único o si hay presencia de dímeros de primers. Hoy en día la mayoría de los software de los termocicladores ofrecen esta función que es fácil de aplicar y analizar. ESPECIFICOS: Los métodos específi cos parten de principios distintos a diferencia de los no específi cos y tienen en común la señal de fl uorescencia emitida para detectar los productos amplifi cados. Estos métodos siguen el principio conocido como «transferencia de energía de resonancia fl uorescente» (FRET, por sus siglas en inglés) para generar la señal; este método consiste en transferir energía desde un donador o reportero fl uorescente a un aceptor o «quencher». Para ello, existen dos métodos específi cos, éstos son: pruebas basadas en hidrólisis y por hibridación. Los primeros se basan en sondas fluorescentes de oligonucleótidos etiquetados con un reportero fl uorescente y un «quencher», ambos se encuentran en estrecha unión mientras la sonda no hibride a su secuencia blanco. Cuando hibrida, ocurren cambios conformacionales en el reportero y el quencher, lo cual permite que la actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa rompa esta unión, logrando que la fl uorescencia emitida por el reportero sea liberada y capturada por el equipo. Estos métodos son muy seguros, ya que mientras no haya unión de la sonda a su blanco, no habrá amplifi cación y tampoco señal de fl uorescencia; es por eso que la especifi cidad es muy alta. Un ejemplo de estos sistemas son las sondas comerciales conocidas como TaqMan12 (Figura 5), aunque existen otras en el mercado. Los métodos específi cos son más costosos que los no específi cos, pero son más efi cientes al garantizar la especifi cidad de la reacción, evitando la formación de productos inespecífi cos. Cualquiera que sea el método que se aplique, se pueden adquirir fácilmente, ya que la gama de sondas para desarrollar, tanto los métodos específi cos como los no específi cos, es amplia FRET EXONUCLEASA 5’3’ son más costosos, más eficientes garantizar especificidad de la reacción, evitando la formación de productos inespecífi cos INESPECIFICO

PCR EN TIEMPO REAL La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artículo de Higuchi y colaboradores (R. Higuchi y col., Biotechnology 1993, 11). utilizando una cámara para monitorear reacciones de PCR durante el curso del termociclado, detectaron la acumulación de ADN doble cadena en cada ciclo de PCR, evidenciado por un incremento en la fluorescencia por la adición de Bromuro de Etidio en la reacción. La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artículo de Higuchi y colaboradores (R. Higuchi y col., Biotechnology 1993, 11). Estos autores, utilizando una cámara para monitorear reacciones de PCR durante el curso del termociclado, detectaron la acumulación de ADN doble cadena en cada ciclo de PCR, evidenciado por un incremento en la fluorescencia producto de la adición de Bromuro de Etidio en la reacción. El aumento de fluorescencia se relaciona directamente con el número de copias de la molécula que está siendo amplificada, presentes inicialmente en la reacción. A menor número de copias presentes inicialmente, menor el número de ciclos necesarios para detectar fluorescencia. PCR TRADICIONAL PCR TIEMPO REAL MEDIDA FINAL DEL PROCESO EN LA FASE EXPONENCIAL RESULTADO CUALITATIVO CUANTITATIVO SENSIBILIDAD BAJA ALTA

Cuantificación de la expresión de genes Control eficacia de fármacos Los datos son tomados en la fase exponencial del proceso, asegura que ningún componente pueda estar limitando el proceso de amplificación. La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artículo de Higuchi y colaboradores (R. Higuchi y col., Biotechnology 1993, 11). Estos autores, utilizando una cámara para monitorear reacciones de PCR durante el curso del termociclado, detectaron la acumulación de ADN doble cadena en cada ciclo de PCR, evidenciado por un incremento en la fluorescencia producto de la adición de Bromuro de Etidio en la reacción. El aumento de fluorescencia se relaciona directamente con el número de copias de la molécula que está siendo amplificada, presentes inicialmente en la reacción. A menor número de copias presentes inicialmente, menor el número de ciclos necesarios para detectar fluorescencia. APLICACIONES: Cuantificación viral Cuantificación de la expresión de genes Control eficacia de fármacos Detección de agentes infecciosos Diagnóstico de tumores Detección de polimorfismos. VENTAJA: más rápida y tiene menos probabilidad de contaminación con lo que disminuyen los falsos positivos

1997 PRIMEROS EQUIPOS PCR TIEMPO REAL En 1997 surgen los primeros equipos comerciales de PCR en tiempo real, producidos por Applied Biosystems. Desde entonces han surgido numerosos equipos con diferentes propiedades, entre elllos destacamos el LighCycler de Roche que esta discontinuado, y el RotorGeneQ. LightCycler® 2.0 Rotor geneQ

APLICACIONES Una de las mayores ventajas de la PCR radica en la facilidad de efectuar un diagnóstico a partir de pequeñas muestras, que se pueden conseguir por medio de métodos como cepillado, aspiración, biopsia e incluso a partir de material de archivo fijado o embebido en parafina Aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa en la medicina actual. Una de las mayores ventajas de la PCR radica en la facilidad de efectuar un diagnóstico a partir de pequeñas muestras, que se puedenconseguir por medio de métodos como cepillado, aspiración, biopsia e incluso a partir de material de archivo fijado o embebido en parafina. Su elevada sensibilidad es la característica que permite demostrar las mutaciones causantes de enfermedades, además de funcionar como marcador biológico de diagnóstico temprano en cáncer y en la identificación de agentes patógenos en medios diluidos HE Algunas pruebas diagnósticas de rutina que se fundamentan en la PCR, son las diseñadas para identificar distrofias musculares de tipo Duchenne o Becker. Estas pruebas examinan la presencia de mutaciones en la región promotora del gen de la distrofina, así como la deleción de exones en el mismo, hechos que en cualquier caso son responsables de generar una proteína anómala. El diagnóstico de la enfermedad de Huntington se puede efectuar mediante la evaluación del número de repeticiones CAG que se han insertado cerca del origen del gen24. Con respecto al cáncer de tipo heredofamiliar, son identificables, en caso de cáncer de mama, las mutaciones en los genes supresores tumorales BRCA1 y BRCA2, así como en el cáncer gástrico lo son las mutaciones en el gen CDH1 de evaluar la expresión génica en diferentes tipos de tejido30,31, de servir como biomarcador en la demostración temprana de enfermedades y en especial de tumores, así como seguir la respuesta a medicamentos14 Identificación de Mycobacterium tuberculosis Tipificación de VPH Identificación de mutaciones o polimorfismos de un gen Identificación de cáncer heredo familiar: cáncer de mama BCRA1 y BCRA 2 Ca. Gastico CDH1 PCR CUANTITATIVA CARGA VIRAL Hep C, HIV mide la cantidad de ARN viral presente sangre

MICROARRAY

ANTECEDENTES HISTORICOS ERA POSGENOMICA ERA PREGENOMICA En la era pregenómica la biología estudiaba los genes individualmente, uno a uno, por lo que los podía estudiar a fondo. Lo que caracteriza la era postgenómica no es lo que se puede medir sino la cantidad de mediciones simultáneas que se pueden realizar. Para cumplir este objetivo y poder estudiar muchos genes a la vez fue necesario un cambio de paradigma: con los mismos recursos, obtener una imagen de menor resolución pero con una perspectiva más general. CANTIDAD DE MEDICIONES SIMULTANEAS MENOR RESOLUCION PERSPECTIVA MAS GENERAL ESTUDIO DE GENES INDIVIDUAL ESTUDIA A FONDO

ANTECEDENTES HISTORICOS El fundamento de los biochips se encuentra en el desarrollo y miniaturización de las técnicas de afinidad que se conocen y han venido empleando desde hace años como una herramienta común en biología molecular. El desarrollo de los primeros ensayos de afinidad con muestras inmovilizadas sobre soportes sólidos con los primeros ensayos inmunológicos que se desarrollaron en los años 60´s y en los que se inmovilizaban sobre una superficie antígenos o anticuerpos (proteinas) para su detección. El siguiente paso en la evolución hacia estos dispositivos se dio en los años 70´s cuando Edwin Southern, comenzó a emplear filtros de nitrocelulosa para que actuasen como soporte sólido para la adhesión de moléculas de ADN. El ADN así inmovilizado mantiene su capacidad de hibridar con moléculas complementarias en disolución. La detección de estas hibridaciones se realizaba mediante la detección de un marcador radiactivo en un revelado por autorradiografía. A este tipo de técnica se la bautizó con el nombre de Southern blot. Con la puesta a punto de la técnica de Southern, el siguiente paso hacia la aparición de los biochips consistió en la construcción de matrices de material biológico inmovilizado por este mecanismo empleando para ello superficies porosas como son las membranas de nitrocelulosa o nylon. Posteriormente se comenzó a trabajar con superficies con tamaños de poro más pequeños y con soportes sólidos como el vidrio y el silicio. Con el desarrollo de las técnicas de miniaturización se comenzó a disminuir el tamaño de los puntos de material depositado sobre la superficie,. Que condujo hasta el desarrollo de las Micromatrices. Desarrollado por el bioquimico Fodor y 4 colaboradores en el instituto de investigacion Affymax. Estas micromatrices se caracterizaron por el almacenamiento de grandes cantidades de datos biológicos en un chip pequeño de vidrio (síntesis de polímeros). como resultado, un gran número de pruebas pueden llevarse a cabo al mismo tiempo en un solo chip de ADN. se utiliza principalmente para detectar enfermedades genéticamente determinadas. George Stark, Universidad de Stanford. Western Blotting Sir Edwin Mellor Southern University of Oxford Stephen Fodor Affymax Research Institute, Palo Alto, USA

Blotting (Transferencia) IDENTIFICACIÓN DE BANDA CONCRETA EN UN GEL DE ELECTROFORESIS La técnica de transferencia (blotting) permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda AC MARCADOS RADIOACTIVIDAD WESTERN BLOT PROTEINAS SOUTHERN BLOT ADN MOL ADN RADIOACTIVAS SECUENCIA CONOCIDA NORTHERN BLOT ARN SONDAS ARN RADIACTIVAS SECUENCIA CONOCIDA

Southern DETECTA SECUENCIA ADN ESPECIFICA SANGRE O TEJIDO ELECTROFORESIS DETECTA SECUENCIA ADN ESPECIFICA SANGRE O TEJIDO Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.1 Su nombre procede del apellido de su inventor, un biólogo inglés llamado Edwin Southern.2 ELECTROFORESIS Se separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis Con proteínas se utiliza un gel de poliacrilamida Con ácidos nucleicos se utiliza un gel de agarosa TRANSFERENCIA (BLOTTING) Se transfieren las bandas de proteínas o de ácidos nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para que puedan reaccionar con la sonda radioactiva. AUTORRADIOGRAFÍA Se añaden Anticueros radiactivos contra una proteína o sondas radioactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotográfica y se revela (B). La técnica de transferencia (blotting) permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos:Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda MOL ADN MUESTRA SEPARAN TAMAÑO ELECTROFORESIS TRANSFERENCIA FRAG ADN TRANFERIDOS DEL GEL DE AGAROSA A MEM. NITRO AUTORRADIOGRAFÍA HIBRIDACION CON SONDAS RADIOACTIVAS CON SECUENCIA COMPLEMTARIA

Northern blotting Detecta secuencia ARN especifica sangre o tejido ANALISIS DE EXPRESION GENICA Northern blot es una técnica de laboratorio que se utiliza para detectar una secuencia de ARN específica en un muestra de sangre o de tejido. Las moléculas de ARN en una muestra se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. Los fragmentos de ARN son transferidas del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a una sonda de ADN marcada con una etiqueta radiactiva o química. Si la sonda se une a la membrana, entonces la secuencia complementaria de ARN está presente en la muestra. Los datos obtenidos con las micromatrices son generalmente consistente con los datos obtenidos del Northern blot; Sin embargo este es capaz de detectar pequeños cambios en la expresión génica que microarrays no puede. La ventaja de que los microarrays tienen sobre Northern blot es que miles de genes se pueden analizar a la vez, mientras que el Northern blot analiza un pequeño número de genes. Un problema con el Northern blot es a menudo la degradación de la muestra por RNasas (tanto endógenos de la muestra y a través de la contaminación del medio ambiente), que se pueden evitar por la esterilización adecuada e inhibidores de RNasa como con DEPC ( pirocarbonato de dietilo ). [ 4 ] Los productos químicos utilizados para la transferencia del Northern puede ser un riesgo para el investigador, ya que el formaldehído, el material radiactivo, bromuro de etidio, DEPC y la luz UV son muy nocivos.  En comparación con la RT-PCR, el Nortern bloting tiene una baja sensibilidad, pero también tiene una alta especificidad que es importante para reducir los resultados falsos positivos. [ 10 ] Las ventajas del uso de Northern blot incluyen la detección de tamaño de ARN, la observación de los productos de corte, la calidad y la cantidad de ARN se puede medir en el gel antes de la transferencia, y las membranas se puede almacenar y reprobar durante años después de secante. [ 10 ] Análisis de la expresión génica se puede hacer por varios métodos diferentes, incluyendo la RT-PCR, ensayos de protección de RNasa, microarrays, análisis en serie de la expresión génica (SAGE), así como transferencia de Northern. [ 3 ] [ 4 ]  Mol ARN muestra separan tamaño ELECTROFORESIS FRAG ARN TRANFERIDOS DEL GEL A MEM. MEM EXPONE SONDA ADN MARCADA (RX , QX) LOS DATOS OBTENIDOS CON LAS MICROMATRICES SON CONSISTNETES CON LOS DEL NB PERO SOLO NB PUEDE DETECTAR PEQUEÑOS CAMBIOS EN EXPRESION GENICA MM ANALIZAN VARIOS GNEES A LA VEZ NB VS PCR-TR < S PERO > E SI UNION SECUENCIA ARN COMPLEMETARIA MUESTRA PRESENTE

MICROARRAY BASADO SINTESIS O FIJACION DE SONDAS QUE REPRESENTAN LOS GENES (PROTEINAS O METABOLITOS Array(colección) de Adn consiste en un gran numero de moleculas de adn ordenadas sobre un sustrato solido de manera que formen una matriz de secuencias. Estos fragmentos de material gnetico pueden ser: Secuencias cortas llamadas oligonucleotidos Mayor tamaño DNAc sintetizado apartir de DNAm Productor de PCR A estos fragmentos de una sola hebra inmovilizados en el sopórte se les denomina sondas MATERIAL GENETICO MAYOR TAMAÑO: ADNc APARTIR DE ARNm PRODUCTOS DE PCR SECUENCIAS CORTAS: OLIGONUCLEOTIDOS Secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares de bases o menos SINTETICOS PROCEDENTES DE GENOTECA GENOMA DE INTERES

MICROARRAY Los acidos nucleídos de Las muestras a analizar se marcan por metodos enzimáticos o fluorescentes y se incuban sobre el panel de sondas lo que permite la hibridación ( es decir el reconocimiento y union entre moleculas complementarias) de secuencias homologas. Durante la hibridacion la muestra del material genetico marcada, se uniran a sus complementarias inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la cuantificacion e identificacion del ADN presente en la muestra (mutaciones, patogenos) Luego estos datos son interpretados por medio de un esconer y herramientas informaticas La fabricacion de estas sondas es gracias al conocimiento y datos de secuencia disponibles en diversas bases de datos y proyectos genomicos. Los productos de PCR CONSISTEN EN FRACICONES de genes generados por PCR Procedentes de clones de ADNc, librerias genomicas o ARN la longitus de estos son de 200 a 500 pares de bases. Los oligonucleotidos tienen un numero de pares de bases mas limitado de 20-25 para analisis de expresion diferencial y hasta 100 para analisis de expresion genica Secuencia de DNA conocida, sintetizada, sondas, fijadas en el chip Muestra, target ADN, ARN PREVIAMENTE MARCADO (SUST. FLUORESCENTE, RADIOACTIVA) VENTAJA A LA PCR EN UN UNICO PROCESO DETECCION MILES DE GENES

CLASIFICACION Material Inmovilizado Soporte/Tipo de Unión Aplicación CLASIFICACION DE LOS MICROARRAYS SEGÚN: CARACTERISTICAS NOMBRE Material Inmovilizado Oligonucleótidos ADNc Proteínas Tejidos Gene Chips ADNc Array Protein Chip Tissue Chip Soporte/Tipo de Unión No poroso/Covalente Poroso/No covalente Soporte rígido (Cristal y Plástico) Membranas Aplicación Secuenciación por hibridación Detección de cambios en la expresión génica Cuantificación de la expresión génica Chips de secuenciación Chips de hibridación comparativa Chips de expresión Array(colección) de Adn consiste en un gran numero de moleculas de adn ordenadas sobre un sustrato solido de manera que formen una matriz de secuencias en 2 dimensiones. Estos fragmentos de material gnetico pueden ser: Secuencias cortas llamadas oligonucleotidos Mayor tamaño DNAc sintetizado apartir de DNAm Productor de PCR A estos fragmentos de una sola hebra inmovilizados en el sopórte se les denomina sondas Los acidos nucleicos de kas miuestras a analizar se marcan por metodos enzomaticos o fluorecentes y se incuban sobre el panel de sondas lo que permite la hibridacion ( es decir el reconocimiento y union entre moleculas complementarias) de secuencias homologas. Durante la hibridacion la muestra del material genetico marcada, se uniran a sus complementarias inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la cuantificacion e identificacion del ADN presente en la muestra (mutaciones, patogenos) Luego estos datos son interpretados por medio de un esconer y herramientas informaticas MICROARRAYS DE DOS CANALES En este tipo de chips de ADN (en inglés spotted microarrays), las sondas son oligonucleótidos, ADN complementario (ADNc) o pequeños fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa, que corresponden con ARN mensajero (ARNm). En este tipo de chip de ADN se utilizan preparaciones de ADNc obtenido a partir de dos muestras biológicas distintas; por ejemplo, de células cultivadas en dos distintas condiciones. El ADNc de cada muestra se marca con un fluoróforo diferente, y las dos preparaciones de ADNc marcadas se mezclan e hibridan sobre el mismo chip de ADN. Una vez realizado este primer paso, se procede al escaneo del resultado y a la visualización del mismo. De esta forma se pueden detectar genes que se activan o se reprimen en distintas condiciones. La contrapartida de estos experimentos es que no se pueden observar niveles absolutos en la expresión y requieren qPCR para un análisis cuantitativo absoluto. Chips de oligonucleótidos de ADN[editar] En los chips de oligonucleótidos de ADN o micromatrices de canal único, las sondas se diseñan a partir de una secuencia conocida o un ARNm predicho. Estos chips de ADNs dan estimaciones del nivel de expresión, pero en una misma matriz no pueden no pueden observarse distintas condiciones, por lo que por cada condición se debe utilizar un chip. Idea principal: las sondas se sintetizan in situ (en el chip). No están basadas en la hibridación competitiva. Esto quiere decir: un chip, una muestra. Las secuencias se construyen en la superficie del chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un solo nucleótido utilizando fotolitografía. GeneChips de Affymetrix[editar] Affymetrix es la compañía líder en este tipo de chips. Se denominan genéricamente "GeneChips". Cada gen representado por un conjunto de secuencias cortas que lo caracterizan. Algunos chips: genomas completos con más de 50.000 grupos de sondas. Chips de ADN para genotipado[editar] Los chips de ADN pueden utilizarse para "leer" las secuencias de un genoma particular en determinadas posiciones. Los SNP arrays son un tipo particular de matrices que se utilizan para identificar variaciones individuales y a través de poblaciones. Los oligonucleótidos pequeños son capaces de identificar polimorfismos de un sólo nucleótido (en inglés SNPs, single nucleotide polymorphisms) que podrían ser los responsables de variaciones genéticas dentro de una población, la fuente de susceptibilidad a distintas enfermedades genéticas e incluso a ciertos tipos de cáncer. En general, la aplicación de estas técnicas de genotipado es forense, ya que son rápidas en descubrir o medir la predisposición de enfermedades o incluso permitir el uso de ciertos medicamentos para tratar ciertas enfermedades según sea el ADN del enfermo o donante. Los chips de ADN de SNPs también se utilizan para la identificación de mutaciones somáticas en cáncer, sobre todo la pérdida de heterocigosis, la amplificación o la deleción de regiones de ADN en el genoma individual de pacientes afectados, es decir, la detección de aberraciones cromosómicas Criterios de clasificacion de Biochips. Adaptado de http://infobiochip.isciii.es

TIPOS SPOTTED/2 COLORES SECUENCIA DE OLIGONUCLOTIDOS SINTETIZADA ANTES DE DEPOSITARLA SOBRE LAS SONDAS

Un laser excita las mol fluorescentes Y SE LEE LA IMAGEN EN 2 CANALES SPOTTED/2 COLORES EN ESTE TIPO DE ARRAYS 2 POBLACIONES DE CLEULAR SON COMPARADAS, CELULAS NORMALES Y PATOLOGICAS, PARA DETERMINAR QUE GENES ESTAN ACTIVADOS Y CUALES REPRIMIDOS SE ASILA EL ARNA DE LAS CELULAS Y PORMEDIO DE TRANCRIPCION REVERSA DE ABTIENE EL ADNC EL CUAL ES MARCADO CON FLUOROCROMOS QUE SON LA CIANINAS CY3 DA EL COLOR ROJO PARA LAS CELULAR ANORMALES Y CY5 DA EL COLOR VERDE PARA LAS CELULAS NORMALES. ESTAS MUESTRAS PROVENIENTES SE MEZCLAN EN CANTIDADES IGUALES Y SE HIBRIDAN COMPETITIVAMENTE EN EL MISMO MICROARRAY LA LECTURA SE HACE CON DETECTORES PARA LOS ESPECTROS DE EMISIÓN DE LOS DOS COLORANTES EN CANALES DIFERENTES Y GENERAR IMÁGENES SEPARADAS PARA CADA UNO DE ELLOS. DE ESTA MANERA LOS PUNTOS QUE RESULTEN VERDES ESTARÁN EXPRESADOS DIFERENCIALMENTE EN UNA CONDICIÓN Y LOS ROJOS EN OTRA, MIENTRAS QUE LOS AMARILLOS ESTARÁN EXPRESANDO AMBAS EN AMBAS CONDICIONES. EXISTEN DOS TIPOS DE LECTORES DE MICROARREGLOS: LOS LECTORES CON CÁMARAS DIGITALES Y LOS LECTORES CONFOCALES. EN LOS LECTORES CON CÁMARAS DIGITALES SE REGISTRA LA IMAGEN FLUORESCENTE COMO SI SE TOMARA UNA FOTOGRAFÍA COMÚN, MIENTRAS QUE EN LOS LECTORES CONFOCALES SE HACE UNA RECONSTRUCCIÓN DE LA IMAGEN POR MEDIO DE FOTOMULTIPLICADORES PARA REGISTRAR LA SEÑAL. ESTOS ÚLTIMOS SON POSIBLEMENTE LOS MEJORES LECTORES PARA MICROARREGLOS; YA QUE PERMITEN OBTENER UNA IMAGEN DE MUY ALTA RESOLUCIÓN, FACTOR DETERMINANTE EN LA OBTENCIÓN DE RESULTADOS; DESAFORTUNADAMENTE ESTOS SON MUY COSTOSOS. EN AMBOS TIPOS DE LECTORES SE UTILIZA UN LÁSER PARA EXCITAR LAS MOLÉCULAS FLUORESCENTES UNIDAS AL CDNA Y PODER OBTENER LA IMAGEN DE CADA UNA DE LAS MUESTRAS CONTENIDAS EN EL MICROARREGLO. CY3 CY5 CÁMARAS DIGITALES O LECTORES CONFOCALES (FOTOMULTIPLICADORES) REGISTRAN LA IMAGEN FLUORESCENTE Un laser excita las mol fluorescentes Y SE LEE LA IMAGEN EN 2 CANALES

SE OBSERVA puntos amarillos, verdes, rojos y un sin numero de tonalidades entre el verde y el rojo. Si para este experimento se marcó la muestra experimental en rojo y la control en verde, todos aquellos puntos que se ven rojos o tonalidades anaranjadas, pueden ser interpretados como genes que aumentaron su expresión. Los puntos verdes o tonalidades entre el amarillo y el verde serán aquellos genes que disminuyeron su expresión. Y finalmente los puntos amarillos representan a los genes que en ambas condiciones se expresan de igual forma.

OLIGONUCLEÓTIDOS SINTETIZADOS INSITU/1 COLOR FOTOLITOGRAFIA FOTOLITOGRAFIA: AQUÍ LOS OLIGONUCLEOTIDOS SON SINTETIZADOS in situ, directamente sobre el soporte, y quedan ancladas a él de modo covalente desde el comienzo de su síntesis hasta su empleo en el ensayo. Puede aplicarse a matrices de péptidos, pero lo más habitual son las matrices de oligonucleótidos. con una sola adaptación, que afecta al grupo protector del extremo de la cadena que ha de reaccionar con el siguiente aminoácido o nucleótido. La retirada de este grupo se hace mediante una reacción fotoquímica: el protector se elimina gracias a la incidencia de luz, generalmente ultravioleta. Por tanto, los puntos de la matriz que sean iluminados quedarán dispuestos para la incorporación del siguiente residuo que se añada, mientras que el resto no experimentan esa elongación La clave está en la utilización de una serie de «máscaras» que bloquean la incidencia de luz en ciertos puntos de la matriz y la permiten en otros. De este modo, EL USO de diferentes máscaras se consigue SINTETIZAR cualquier combinación de moléculas, con secuencia diferente en cada una de las posiciones de la matriz. . POSICIONES TRANSPARENTES PASO LUZ UV AFECTA GRUPO PROTECTOR DE LA CADENA QUE REACCIONARA CON EL SIGUIENTE NUCLEOTIDO NO SE BASAN EN HIBRIDACIÓN COMPETITIVA: CADA CHIP CONTIENE MUESTRAS DE UN SOLO TIPO

Genechip CADA GEN ESTA REPRESENTADO POR GRUPO DE SONDAS CORTAS EN VEZ DE POR UNA SOLA SONDA. ALGUNOS CHIPS CONTIENEN GENOMAS COMPLETOS CON MÁS DE 50.000 GRUPOS DE SONDAS UN GRUPO DE SONDAS SE UTILIZA PARA MEDIR NIVELES DE MRNA DE UN ÚNICO GEN Distintos “Pares de Sondas” representan partes distintas del mismo gen (1 gen=1 grupo de sondas) Las sondas se seleccionan para ser especificas del gen que representan y tener buenas propiedades de hibridación.

Genechip CADA CELDA CONTIENE MÚLTIPLES COPIAS DE LA MISMA SECUENCIA Para la impresión de los microarreglos tener en cuenta los siguientes aspectos: de la biblioteca genómica que se desea imprimir debe tener la mayor cantidad de información de cada gen y esta información tiene que estar ordenada en una base de datos; el DNA que se va a imprimir, debe tener la misma calidad que se requiere cuando se va a secuenciar; la cantidad de DNA de cada muestra debe ser la misma y en una solución con un contenido especifico de sales. También se deben controlar la humedad y la temperatura. Una vez impresas las laminillas, el DNA debe ser fijado a la superficie. Esto se puede lograr horneando los microarreglos a 80°C por cuatro horas o con un entrecruzador de luz ultravioleta. Adicionalmente se delimita la región donde se encuentra el microarreglo y se identifica cada laminilla, ya sea con un código de barras o un numero se serie. Obtener el equipo, contar con las bibliotecas genómicas ordenadas y establecer las condiciones para la impresión de microarreglos; requiere de una gran cantidad de recursos económicos y tiempo. Por ello es recomendable obtener los microarreglos ya elaborados. Existen diversas compañías que comercializan microarreglos y en la UNAM se cuenta con una unidad de microarreglos de DNA, creada para ofrecer a la comunidad científica y tecnológica del país, servicios de impresión de microarreglos, marcado de sondas, lectura de microarreglos y cuantificación de los mismos. SE REALIZA LA HIBRIDACIÓN, DEPOSITANDO EL mRNA MARCADO OBTENIDO DEL TEJIDO A ESTUDIAR SOBRE CADA CHIP CADA CELDA CONTIENE MÚLTIPLES COPIAS DE LA MISMA SECUENCIA

Genechip AISLAMIENTO Y PURIFICACION DEL ARN MUESTRA AISLAMIENTO Y PURIFICACION DEL ARN Cada tipo celular tiene un transcriptoma característico. Definición: El transcriptoma es el conjunto de genes que se están expresando en un momento dado en una célula. La expresión de un gen supone que éste ha sido transcrito a ARN mensajero. Células de un mismo organismo y con un mismo genoma pueden llegar a ser tipos celulares muy dispares dependiendo de la combinación de genes que exprese cada una, lo que es lo mismo, dependiendo de su transcriptoma. En un organismo pluricelular el genoma codifica toda la información necesaria para producir los diferentes tipos celulares que componen el organismo adulto. Dependiendo del tipo celular y el estado fisiológico en el que se encuentre la célula encontraremos un patrón de genes activos que difieren según el tipo celular y/o estado fisiológico. Además de los diferentes genes activos en un momento dado, que generan un conjunto particular de ARNs mensajeros, también se transcribe ADN que no es traducido a proteína. Este ARN no codificante tienen un importante papel regulador sobre la expresión de genes Obtención de RNA El aislamiento del RNA para su utilización en microarreglos, no difiere de los protocolos habituales para purificar RNA total. Solo se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: obtenerlo lo más concentrado posible; que la banda ribosomal grande sea al menos dos veces mas que la banda pequeña (este relación nos permite tener una idea de la integridad del mRNA); se requieren al menos 30μg de RNA total para realizar un experimento; no se requiere aislar el RNA mensajero y puede no ser importante la presencia de DNA genómico. En cuanto a los métodos para purificar RNA se puede consultar los reportados, aunque es recomendable utilizar kits comerciales y consultar con colegas que tengan experiencia en el aislado de RNA. En la Figura 6 se muestra un ejemplo de RNA total de levadura con las características mencionadas. Marcado del RNA Para el marcado del RNA (sonda) se utiliza la síntesis invitro de cDNA de cadena sencilla. En los métodos más comunes; se coloca el RNA total junto con un deoxioligonucleótido poli T y un conjunto de hexámeros al azar, permitiendo que reconozcan sus sitios en el RNA mensajero. Posteriormente se agregan los deoxinucleótidos A, C, G y T, mas una proporción de deoxinucleótido T marcado con una molécula fluorescente (comercialmente se pueden obtener dUTP-Cy3, dUTP-Cy5, dUTP-alexa3 y dUTP-alexa5; también se pueden obtener los mismos fluoróforos unidos a dCTP). A la mezcla se agrega transcriptasa inversa que sintetiza el cDNA a partir del mRNA, incorporando el deoxinucleótido T marcado en dos reacciones estándar. Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar el deoxinucleótido fluorescente no incorporado al cDNA y se tiene la sonda marcada, lista para probarla en un microarreglo. En la Figura 7 se muestra un gel de electroforesis en el que se corrieron RNA total y RNA mensajero, marcados con los fluoróforos descritos. Para el marcado del RNA (sonda) se utiliza la síntesis invitro de cDNA de cadena sencilla

PROCEDIMIENTO REVELADO Deteccion de marcadores fluorescentes: cámaras ccd (couple charge device, dispositivo multiplicador de carga) o escáner láser.

MICROARRAYS Diagnostico molecular y pronostico de enfermedades Monitorización de la expresión génica Farmacogenómica. Medicina personalizada Diagnostico molecular y pronostico de enfermedades Detección de agentes infecciosos

APLICACIÓN: DIAGNOSTICO MOLECULAR CHIPS PARA IDENTIFICACION DE SPNS FIJAN AL SOPORTE OLIGOS SINTETICOS 7-30 BASES > N° IDENTIFICACION DIFICIL Para la identificacion de polimorfismos de un solo nucleotido, este tipo de chips fija al soporte oligonucleotidos sinteticos de 7 a 30 bases, pues con mayor numero es dificil identificar. Cada uno de ellos representa un fragmento de un determinado gen de modo que se puedan localizar variantes de genes conocidos asi como detectar mutaciones por deleccion o insercion. . Este analisis se realizando fijando a la matriz secuencias que contengan mutaciones conocidas ( ej, todas de un determinado gen para detectar cual es la que tiene ese gen en la muestra problema CADA OLIGO REPRESENTA UN FRAGMENTO DE UN DETERMINADO GEN SE FIJA AL A MATRIZ SECUENCIAS DE MUTACIONES CONOCIDAS. TODAS LA DE UN DETERMINADO GEN SE PUEDE LOCALIZAR VARIANTES DE GENES CONOCIDOS ASÍ COMO DETECTAR MUTACIONES POR DELECCIÓN O INSERCIÓN.

APLICACIÓN: DIAGNOSTICO MOLECULAR CHIPS DE CARACTERIZACION GENICA PREDISPOSICION HACIA UNA ENFERMEDAD BASANDOSE EN: Los chips de caracterizacion gentica: se emplean para encontrar la posible predisposicion de una persona hacia una enfermedad basandose en el analisis de mutaciones en un individuo o en una familia. Para elaborar estos chips diagnosticos se utilizan secuencios que contiene distintas mutaciones en protoncogenes o en genes supresores de tumor (Los protooncogenes son genes cuyos productos promueven el crecimiento y la división de la célula. Codifican factores de transcripción que estimulan la expresión de otros genes, moléculas de transducción de señales que estimulan la división celular y reguladores del ciclo celular que hacen que la célula progrese a través de este ciclo) cuya presencia en las celulas tumorales atribuye a distintas caracteristicas al tumor en cuestion. En células cancerosas, uno o más de un protooncogén está alterado de manera que su actividad no puede ser controlada de manera normal. A veces eso es debido a una mutación en el protooncogén que resulta en un producto protéico que funciona de manera anormal. Otras veces, los protooncogenes pueden codificar productos proteicos normales, pero los genes se sobre-expresan y no pueden ser transcripcionalmente reprimidos en el momento adecuado. En otros casos, el producto del protooncogén está continuamente activo, lo que estimula constantemente la célula a dividirse. Cuando un protooncogén está mutado o se expresa incorrectamente, y contribuye al desarrollo de un cáncer, pasa a denominarse oncogén (gen que causa cáncer). Los oncochips contienen 6500 gene seleccionados por su implicacion en procesos tumorales a partir de 35000 genes identificados por el proyecto genome humano. Las aplicaciones mas importantes se encuentra la prediccion del desarrollo clinico de un tumor y de su posible respuesta a distintos farmacos. ANALISIS DE MUTACIONES FAMILIAS O INDIVIDUOS PARA ELABORARLOS UTILIZAN SECUENCIAS DE MUTACIONES EN PROTONCOGENES ONCOCHIPS CONTIENEN 6500 GENES SELECCIONADOS POR SU IMPLICACION TUMORES DE 35000 GENES DEL GH PREDICCION DESARROLLO CLINICO DEL TUMOR Y RESPUESTA FARMACOLOGICA

DIAGNOSTICO INMUNOLOGIA

ARRAY DE PROTEINAS ESTUDIA SIMULTANEMAMENTE MILES DE PROTEINAS ARRAY DE PROTEINAS PERMITEN ESTUDIAR DE FORMA SIMULTANEA Y MASIVA MILES DE PROTEINAS. AUN SE ENCUENTRAN EN DESARROLLO DEBIDO A LA NECESIDAD DE MANTENER LA INTEGRIDAD ESTRUCTURAL Y PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LAS PROTEINAS SE CLASIFICAN EN: ARRAY DE PROTEINAS DIANA .- DONDE LOS AGENTES DE CAPTURA SON ANTICUERPOS O PREOTEINAS RECOMBINANTES SON INMOVILIZADOS PARA POSTERIORMENTE INCUBARSE CON LA MUESTRA DE INTERES. SE USAN PARA EL ESTUDIO DE PATRONES DIFERENCIALES DE EXPRESION PROTEICA, DE ACUERDO A SU AFINIDAD O ESPECIFICIDAD PERO TIENE INCOVENIENTES DEBIDO A SU REACTIVIDAD CRUZADA O PERDIDA DE ACTIVIDAD PROTEICA POR SU INMOVILIZACION. ARRAYS EN FASE REVERSA (RPP).- AQUÍ SE INMOVILIZA LISADOS CELULARES O DE TEJIDOS O SUERO, PARA LA POSTERIOR DETECCION KMEDIANTES U N ANTICUERPO CONTRA LA PROTEINA DIANA ESPECIFICA. ESTA UNION SE REVELA MEDIANTE UN AC SECUNDARIO CONJUGADO CON UNA ETIQUETA Q AMPLIFICA LA SEÑAL. LA PROBABILIDAD DE NO DETECTAR LA PROTEINA DE INTERES ES BAJA SI SE ENCUENTRA EN BAJAS CANTIDADES. SE USAN PARA EL ANALISIS DE MODIF POSTRANSDUCCIONALES O ESTUDIO DE RUTAS DE SEÑALIZACION CELULAR CON GRAN POTENCNIAL PARA EL DESARROLLO DE TERAPIAS PERSONALIZADAS LOS AGENTES DE CAPTURA SON AC O PP RECOMBINANTES SON INMOVILIZADOS PARA INCUBARSE CON LA MUESTRA DE INTERES. USOS: ESTUDIO DE PATRONES DIFERENCIAL ES DE EXPRESION PROTEICA (PERFIL PROTEOMICO) DESVEN: PERDIDA DE ACTIVIDAD PROTEICA POR INMOV ARRAYS DE PP DIANA SE INMOVILIZA LISADOS CELULARES, TEJIDOS, SUERO POSTERIOR DETECCION MEDIANTE UN ANTICUERPO CONTRA LA PROTEINA DIANA. AC SECUNDARIOCONJUGADO CON UNA ETIQUETA PARA AMPLIFICAR LA SEÑAL DE UNION SE USAN PARA EL ANALISIS DE MODIF POSTRANSDUCCIONALES O ESTUDIO DE RUTAS DE SEÑALIZACION CELULAR CON GRAN POTENCIAL PARA EL DESARROLLO DE TERAPIAS PERSONALIZADAS ARRAS EN FASE REVESA (RPP)

NAPPA (NUCLEIC ACID PROGRAMMABLE PROTEIN ARRAY) ARRAYS DE PROTEINAS IN SITU IMRESION MATERIAL GENETICO CODIFICANTE UTIIZA LA LIBRERÍA DE ADNc HUMANA EL CONTENIDO PROTEICO SE GENERA IN SITU MEDIANTE UN SISTEMA DE EXPRESION IN VITRO LO QUE FAVORECE EL PLEGAMIENTO Y MODIFICACIONES POSTRANSDUCCIONALES DE LAS PROTEINAS La GST humana de la clase pi (hGST P1-1) está implicada en el desarrollo de resistencia de tumores frente diversos fármacos anticancerígenos (2). Se ha observado que la expresión de hGST P1-1 es elevada en algunos tumores humanos como cánceres de pulmón, colon, ovario, testículos, vejiga, bucal y riñón. Por tanto el uso de inhibidores específicos de la enzima podrían potenciar la eficacia de la quimioterapia sobre tumores resistentes a drogas anticancerígenas ARRAYS DE PROTEINAS IN SITU.- se realiza a partir de la impresión de material genético codificante sin necesidad de recurrir a complejos y costosos procesos de purificación e impresión de proteínas. Para la producción de los microarrays se utiliza la librería de cDNA´s humanos El contenido proteico del microarray se genera in situ, mediante un sistema in vitro de expresión mamífero, lo que favorece el plegamiento y modificaciones post-traduccionales de la proteínas. NAPPA permite la expresión de hasta 7500 proteínas humanas diferentes, de una gran variedad y con un alto rendimiento¹. Se estima que este tipo de microarrays rinde hasta 1000 veces más cantidad de proteína por spot, que la que está disponible en los microarrays de proteína convencionales, en los que además, las proteínas deben ser purificadas independientemente e impresas sobre la superficie del microarray. NAPPA puede ser empleado en numerosas aplicaciones como el estudio de interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-fármaco e identificación de biomarcadores2. Estudios realizados por Proteomika han demostrado la utilidad de la tecnología NAPPA en el campo de la identificación de autoanticuerpos en pacientes con cáncer. Los resultados permiten establecer perfiles autoinmunes característicos y la identificación de autoanticuerpos que pueden servir como marcadores precoces de ciertos cánceres. NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array) PERMITE LA EXPRESION 7500 PP DIF RINDE 1000 VECES MAS PP Q LOS ARRAY DE PP CONVENCIONALES. ESTUDIA LA INTERACC P-P, P-F, IDENTIF BIOMARCADORRES PERMITEN ESTABLECER PERFILES AUTOINMUNES CARACTERÍSTICOS Y LA IDENTIFICACIÓN DE AUTOANTICUERPOS QUE PUEDEN SERVIR COMO MARCADORES PRECOCES DE CIERTOS CÁNCERES. PROTEOMIKA

MICROARRAYS