Siembra

Sembrar un microorganismo es… Colocarlo en un ambiente artificial apropiado para que lleve a cabo su metabolismo, su desarrollo y su reproducción. Las técnicas de siembra varían según el estado físico del medio o las necesidades gaseosas de los microorganismos (aerobios, anaerobios, etc)

Una condición básica de la siembra es que se realice bajo rigurosas reglas de asepsia, ya que es indispensable evitar el crecimiento de gérmenes del ambiente en el cultivo. Estos microorganismos se denominan contaminantes. La siembra tiene como finalidad el cultivo, que es el crecimiento de poblaciones microbianas en un medio de cultivo bajo condiciones de laboratorio.

Una de estas condiciones es la temperatura de incubación, necesaria para brindarle a los microorganismos las condiciones óptimas para su crecimiento in vitro. Los gérmenes poseen diferentes temperaturas de desarrollo; la mayoría lo hace a 35°C . Sin embargo, algunas pueden crecer a altas temperaturas y otras a bajas.

Como cultivos a 60°C típicos de S.faecalis cultivos a 44°C típico de E.coli O bajas a 4°C para el cultivo de Listeria puede obtenerse sólo el crecimiento de estos microorganismos. Para el desarrollo de gérmenes aerobios basta con colocar directamente las cajas o tubos sembrados a 35°C en estufas para cultivo cuya atmósfera es igual a la del ambiente.

Las placas o tubos sembrados con muestras donde se sospeche la presencia de bacterias anaerobias, independientemente del recipiente en la que se genere esta atmósfera, deben incubarse al menos durante 48 hs entre los 35 y 37° C y reincubarse durante 2 o 4 días más para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias.

Luego de la inoculación y la incubación en el medio de cultivo, se producirá en el lugar donde se depositan los microorganismos su multiplicación, la que se traduce en la formación de una masa macroscópicamente visible denominada colonia, que es un clon procedente de un mismo germen y a partir del cual es posible realizar el aislamiento y el trasplante.

Aislamiento Al sembrar el material proveniente de una muestra clínica por lo general se obtiene un cultivo mixto, del cual es imprescindible separar los distintos tipos de colonias para obtener cultivos puros, por que los cultivos mixtos proporcionan información de poca utilidad e incluso errónea.

Sólo los cultivos puros permiten realizar estudios sobre las propiedades bioquímicas (pruebas de identificación o tipificación) y la sensibilidad a los antimicrobianos selectivos (antibiograma)

Existen varias técnicas de aislamiento; las más utilizadas siempre se basan en el empleo de un medio de cultivo sólido, en el cual los microorganismos dan origen a colonias separadas. Como cada colonia procede de una sola célula, cuando se tiene un inóculo medido, se habla de unidades formadoras de colonias(UFC).

Los métodos de aislamiento más frecuente son: Siembra por agotamiento por estrías. Siembra por diseminación en superficie. Siembra de diluciones seriadas.

Siembra por agotamiento por estrías Método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo (material microbiano utilizado para sembrar un medio de cultivo) sobre un medio sólido contenido en una cápsula de Petri. A medida que se hacen estrías las bacterias pasan del asa al medio en un número cada vez menor, de manera que las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluyente, mientras que a lo largo de las últimas estrías se desarrollan colonias bien aisladas.

Siembra por diseminación en superficie. Este método consiste en colocar 0,005mL ( una gota) del inóculo en el centro de una placa de Petri con medio de cultivo. Se extiende con espátula de Drigalsky hacia adelante y atrás, mientras se hace girara la placa, se tapa se invierte la placa y se lleva a incubar.

Siembra de diluciones seriadas. Este método consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra con el objeto de sembrar despúes cantidades conocidas de esas diluciones en placas de Petri. Esto permite conocer el número de microorganismos viables. La viabilidad en microbilogía se define como la capacidad del microorganismo para multiplicarse en un medio de cultivo.

Examen de las características de un cultivo La determinación de las características generales de las colonias debe realizarse a tráves de la inspección macroscópica de la superficie del agar. El estudio de colonias incluye determinar su tamaño, forma, elevación margen o bordes, color, superficie, densidad y consistencia.

Deben también considerarse las reacciones que se producen en el agar, por ejemplo tipos de hemólisis en agar sangre ( alfa, beta gamma), producción de pigmentos y cambios en los medios diferenciales en los cuales los colorantes indicadores de pH y otros ingredientes sirven como marcadores de actividad enzimáticas y ayudan a la identificación de los aislamientos microbianos.

Trasplante El trasplante de un microorganismo consiste en sembrarlo en un nuevo medio de cultivo a fin de perpetuar la especie aislada. Luego de realizar una siembra es imprescindible proceder a la incubación a tempertaura adecuada y durante el tiempo necesario para favorecer el crecimiento de los microorganismos.

Como los trasplantes requieren de la existencia permanente de medios de cultivo, tiempo y mucho dinero, los laboratorios clínicos recurren a métodos de conservación menos costosos ,más efectivos y seguros, cuyo objetivo es la preservación.

La preservación de cepas viables en el laboratorio de microbiología tienen como propósitos: 1-Mantenimiento de cepas para la identificación definitiva por un laboratorio 2-Realización de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos no habituales 3-Fines didácticos 4-Realización de diversos trabajos de investigación 5-Realización de estudios epidemiológicos en casos de brotes de infecciones nosocomiales.

La preservación puede llevarse a cabo por técnicas como: -Para conservar las cepas durante un corto plazo se utiliza refrigeración. -Para mantenerlas durante largos períodos se dispone de: a-) Criopreservación: consiste en el congelamiento y almacenamiento de células vivas a muy bajas temperaturas.

Con el objeto de minimizar los daños que produce la congelación sobre las células vivas se agregan distintos compuestos químicos a la suspensión celular; estos compuestos se denominan crioprotectores y los más comunes son: leche descremasa, glicerol ,sacarosa,etc. La temperatura de mantenimiento para bacterias y hongos es de -60-70°C; en estas condiciones el período de conservación supera los 10 años.

b-) Liofilización: consiste en la eliminación de agua y otros solventes a partir de una solución congelada por medio de una sublimación. Esto permite conservar el material a temperaturas superiores a las requeridas para mantener suspensiones congeladas. El resultado es un producto estable y fácilmente rehidratable. Con este método puede llegar a lograrse períodos de conservación de más de 20 años.

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