Estabilización de enzimas mediante métodos de inmovilización Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores Estabilización de enzimas mediante métodos de inmovilización

Rigidificación de la estructura 3-D Curso Posgrado 2012 ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MEDIANTE PROCESOS DE INMOVILIZACIÓN MECANISMOS DE INACTIVACIÓN DE ENZIMAS Alta temperatura Disolventes pHs extremos M. acuoso pH neutro 4º C + Rigidificación de la estructura 3-D Estabilización de la estructura cuaternaria

MECANISMOS DE ESTABILIZACIÓN POR INMOVILIZACIÓN Curso Posgrado 2012 MECANISMOS DE ESTABILIZACIÓN POR INMOVILIZACIÓN RIGIDIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D ESTABILIZACIÓN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA +

ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS POR Curso Posgrado 2012 ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS POR INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL Muchos residuos de la enzima Brazos espaciadores muy cortos Soporte rígido Posiciones relativas invariables durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente distorsionarte ESTABILIZACIÓN 3-D COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES

Inmovilización – estabilización enzimas multiméricas Curso Posgrado 2012 Inmovilización – estabilización enzimas multiméricas inmovilización intensa multisubunidades CHO inmovilización intensa multisubunidades - entrecruzamiento con polialdehidos entrecruzamiento con polialdehidos J. Mol. Catal. B- Enzym.1999. 7, 181-189.

Desorción de sub-unidades de derivados inmovilizados Curso Posgrado 2012 Desorción de sub-unidades de derivados inmovilizados de extractos crudos de E. coli sobre Sepabeads epóxido 94000 67000 43000 30000 1 2 3 4 5 2.- Extracto crudo 3.- Desorción después de inmovilización a pH 7.0 4.- Desorción después de incubación a pH alcalino 5.- Desorción después de tratamiento con polialdehidos + SDS – 100 ºC Estabilización de “todas” las proteínas multiméricas

Estabilización de acilasa de A. turbidans Curso Posgrado 2012 Estabilización de acilasa de A. turbidans Condiciones: pH 6.5 25º C

+ + RESULTADOS PREVIOS J. Mol. Catal. B- Enzym. 2001. 11, 633-638 Curso Posgrado 2012 RESULTADOS PREVIOS + + J. Mol. Catal. B- Enzym. 2001. 11, 633-638 Biomacromolecules. 2001. 2, 95-104 Biotechnol. Progr. 2001. 17,537-542 J. Mol. Catal. B- Enzym. 1999. 7, 173-179.

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES Curso Posgrado 2012 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES Soportes glioxil Inmovilización de las dos subunidades a través de la región más rica en lisinas Inmovilización a pH 10 Guisán. Enzyme Microb. Technol. 1988 10, 375-82 9

INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES Curso Posgrado 2012 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS A TRAVÉS DE DIFERENTES ORIENTACIONES + Inmovilización de solo una subunidad por la región más rica en lisinas

máxima estabilización posible de todas las enzimas multiméricas Curso Posgrado 2012 Objetivo planteado: máxima estabilización posible de todas las enzimas multiméricas Desarrollo de una nuevo tipo de soportes heterofuncionales a medida y protocolos de inmovilización en varias etapas Grupos capaces de adsorber multiméricas involucrando el máximo numero de subunidades a pH 7…….orientación correcta Grupos CHO …………………Unión Covalente Multipuntual muy intensa, a través de los grupos aminos, a pH 10

ESTUDIO DEL PROCESO DE ADSORCIÓN Curso Posgrado 2012 ESTUDIO DEL PROCESO DE ADSORCIÓN +2 - + Adsorción multipuntual involucrando varios residuos en la superficie de la proteína

ADSORCIÓN DE ENZIMAS GRANDES SOBRE SOPORTES POCO ACTIVADOS Curso Posgrado 2012 ADSORCIÓN DE ENZIMAS GRANDES SOBRE SOPORTES POCO ACTIVADOS - Enzimas grandes adsorbidas por regiones muy grandes J. Chromatogr. A. 1059, 89-94.

Adsorción multipuntual y multisubunidades Curso Posgrado 2012 HIPÓTESIS Adsorción multipuntual y multisubunidades Adsorción multipuntual de una sola subunidad

Mínimo de grupos que permite adsorción a pH 7: Curso Posgrado 2012 DISEÑO DE NUEVOS SOPORTES HETEROFUNCIONALES PARA LA INMOVILIZACIÓN MULTIPUNTUAL Y MULTISUBUNIDADES DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS Mínimo de grupos que permite adsorción a pH 7: Garantía de mayor superficie Muchos grupos CHO que no unen a pH 7 y unen a pH 10 para UCM CHO +2 - +

Union covalente suave pH neutro Adsorción a pH neutro Incubación a Curso Posgrado 2012 Union covalente suave pH neutro Adsorción a pH neutro Incubación a pH alcalino CHO CHO 16

INGENIERÍA GENÉTICA DE ENZIMAS DE ESTRUCTURA 3-D CONOCIDA Curso Posgrado 2012 INGENIERÍA GENÉTICA DE ENZIMAS DE ESTRUCTURA 3-D CONOCIDA SH SH HS

a pH neutro por intercambio tiol disulfuro Curso Posgrado 2012 CHO H S CHO Inmovilización a pH neutro por intercambio tiol disulfuro UCM amino-glioxil a pH alcalino

Orientación deseada + Unión Covalente Multipuntual Curso Posgrado 2012 Orientación deseada + Unión Covalente Multipuntual 19

VALIDEZ PARA OTRAS ENZIMAS MÁS COMPLEJAS Curso Posgrado 2012 VALIDEZ PARA OTRAS ENZIMAS MÁS COMPLEJAS Enzimas más complicadas… tratamiento con polímeros

ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS DE MICROORGANISMOS TERMÓFILOS Curso Posgrado 2012 ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS DE MICROORGANISMOS TERMÓFILOS Enzima de mesófilo Enzima de termófilo Mesófilo Vs termófilo Unión unisubunidad Vs multisubunidades Unión unipuntual Vs multipuntual DERIVADOS MÁS ESTABLES 21

Curso Posgrado 2012 Unión de enzimas con varios aminos terminales a soportes activados con grupos glioxil pH 7 Hipótesis multiméricas: NH2 NH2 NH2 pH 8 Si hubiera varios aminos terminales en un mismo plano de la proteína esta se podría inmovilizar multipuntualmente sobre glioxil a pH 7-8 Ésta inmovilización debería involucrar a muchas subunidades

Curso Posgrado 2012

CLEAs precipitante PEG sales, disolventes Agente entrecruzante Curso Posgrado 2012 PREPARACIÓN DE CLEAs precipitante PEG sales, disolventes Agente entrecruzante CLEAs

Efecto de la dilución en la estabilidad térmica Curso Posgrado 2012 Efecto de la dilución en la estabilidad térmica de CLEA catalasa de M. lysodeiktycus Actividad residual (%) Condiciones experimentales: 60ºC , pH 7, 10000 IU/ml Tiempo (h) Inmovilización convencional de enzimas: Disociación de subunidades es posible CLEA: Disociación de subunidades no es posible

Aumentar la concentración de sustratos poco solubles. Curso Posgrado 2012 BIOTRANSFORMACIONES ENZIMÁTICAS EN PRESENCIA DE DISOLVENTES Aumentar la concentración de sustratos poco solubles. Evitar etapas de cristalización, realizando la biotransformación en presencia de agua saturada de disolvente. Desplazar equilibrios hacia la síntesis. Modificar la selectividad de las enzimas al inducir cambios en la conformación y en el mecanismo de reacción. PROBLEMA: INESTABILIDAD DE LAS ENZIMAS EN PRESENCIA DE DISOLVENTES

No se produce modificación química Curso Posgrado 2012 INACTIVACIÓN DE ENZIMAS INMOVILIZADAS EN PRESENCIA DE MEZCLAS AGUA-DISOLVENTE ORGÁNICO (pH neutro y baja Tª) No se produce modificación química No es posible agregación (enzima inmovilizada) No existe inactivación por interfase hidrofóbicas CAUSA DE INACTIVACIÓN: Cambios conformacionales inducidos por el disolvente. Enzima desnaturalizada Enzima hidratada Enzima interacciona con disolvente Codisolvente Medio acuoso pH 7 4’C

ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS FRENTE A DISOLVENTES ORGÁNICOS Curso Posgrado 2012 ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS FRENTE A DISOLVENTES ORGÁNICOS Presencia de disolventes en el entorno enzimático REDUCCIÓN DE: Cambios conformacionales en la estructura enzimática RIGIDIFICACIÓN GENERACIÓN DE MICRO-AMBIENTES HIPER-HIDROFÍLICOS AUMENTO DE LA ESTABILIDAD DERIVADO ENZIMÁTICO

Rigidificación 3D A través de: varios residuos de la enzima Curso Posgrado 2012 A/ REDUCCIÓN DE LOS CAMBIOS CONFORMACIONALES EN LA ESTRUCTURA ENZIMÁTICA Estabilización de la enzima por UNIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL A través de: varios residuos de la enzima unidos por brazos espaciadores cortos al soporte Reduce los cambios conformacionales inducidos por cualquier agente distorsionante Rigidificación 3D

B/ REDUCCIÓN DE LA PRESENCIA DE DISOLVENTES EN EL ENTORNO ENZIMÁTICO Curso Posgrado 2012 B/ REDUCCIÓN DE LA PRESENCIA DE DISOLVENTES EN EL ENTORNO ENZIMÁTICO S P 90% CODISOLVENTE 30% Generación capas hidrofílicas protegiendo a cada molécula de enzima: Estructuras muy abiertas (permitan paso S y P) polímeros no estructurados Capa altamente hidrofílica (fenómenos de “reparto” = disminución % disolvente en el entorno de la enzima)

+ = GENERACIÓN DE MICRO-AMBIENTES HIDROFÍLICOS Curso Posgrado 2012 GENERACIÓN DE MICRO-AMBIENTES HIDROFÍLICOS ALREDEDOR DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS + = Unión covalente multipuntual Generación de micro-ambientes Derivado PGA-glioxil-agarosa (estabilizado)

Características generales: altamente hidrofílicos Curso Posgrado 2012 COINMOVILIZACIÓN DE LA ENZIMA CON POLÍMEROS HIDROFÍLICOS POLIFUNCIONALES NO ESTRUCTURADOS Características generales: altamente hidrofílicos estructuras abiertas y flexibles contienen gran cantidad de grupos funcionales capaces de generar microambientes hidrofílicos en torno a cada molécula de enzima Tipos: A/ Polietilenimina (PEI) B/ Dextrano aldehído C/ Dextrano sulfato Condiciones de inactivación:  Alta concentración de disolvente orgánico (80,90%,…)  Baja temperatura (4º C)  pH neutro

A/ POLIETILENIMINA (PEI) Curso Posgrado 2012 A/ POLIETILENIMINA (PEI) 1/Los grupos amino primarios pueden reaccionar con: Grupos aldehído en el soporte Grupos aldehído de polímeros + - NH2 2/Los grupos amino ionizados pueden adsorberse sobre: Polímeros poli-aniónicos Proteínas

Polímeros con aminos primarios (PEI) Proteínas Curso Posgrado 2012 B/ DEXTRANO - ALDEHÍDO Reaccionan con grupos amino primarios de: Soportes Polímeros con aminos primarios (PEI) Proteínas CHO

-O-SO3- Se adsorben a: Proteínas Polímeros policatiónicos (PEI) Curso Posgrado 2012 C/ DEXTRANO- SULFATO Se adsorben a: Proteínas Polímeros policatiónicos (PEI) “sal polimérica” extremadamente hidrofílica -O-SO3-

OPTIMIZACIÓN DEL DERIVADO ENZIMÁTICOS CON MICROAMBIENTES HIDROFÍLICOS Curso Posgrado 2012 OPTIMIZACIÓN DEL DERIVADO ENZIMÁTICOS CON MICROAMBIENTES HIDROFÍLICOS Coinmovilización de PGA y Polietilenimina de distinto tamaño: NO ESTABILIZACIÓN PGA no interacciona con soportes modificados con PEI DISOLVENTE ORGÁNICO PGA Polietilenimina

La capa hidrofílica es muy fina y no cubre completamente Curso Posgrado 2012 Modificación de derivados de PGA con PEI- dextrano sulfato: ESTABILIZACIÓN MUY MODERADA La capa hidrofílica es muy fina y no cubre completamente todas y cada una de las moléculas de PGA DISOLVENTE ORGÁNICO PGA Dextrano sulfato Polietilenimina

INACTIVACIÓN EN 90 % Dioxano, 4ºC, pH 7.0 Curso Posgrado 2012 Modificación de derivados de PGA con PEI-dextrano aldehído: ESTABILIZACÓN ELEVADA INACTIVACIÓN EN 90 % Dioxano, 4ºC, pH 7.0 Tiempo (horas) Actividad enzimática residual (%) PEI 1000 KD PEI 60 KD PEI 25 KD

La capa hidrofílica cubre completamente todas Curso Posgrado 2012 La capa hidrofílica cubre completamente todas y cada una de las moléculas de PGA DISOLVENTE ORGÁNICO PGA Dextrano aldehido Polietilenimina

1º- Inmovilización covalente multipuntual 2º- Coinmovilización con PEI Curso Posgrado 2012 PROTOCOLO OPTIMIZADO 1º- Inmovilización covalente multipuntual 2º- Coinmovilización con PEI 3º- Reacción entre PEI y dextrano-aldehído (varias capas) 4º- Formación de sales poliméricas con dextrano sulfato

3 capas + Dextrano sulfato (75% actividad recuperada) Curso Posgrado 2012 DERIVADO FINAL ÓPTIMO INACTIVACIÓN EN 90 % Dioxano, 4ºC, pH 7.0 3 capas + Dextrano sulfato (75% actividad recuperada) Glioxil-PGA 1 capa Eupergit-PGA comercial

DERIVADO HIDROFILIZADO Curso Posgrado 2012 PGA Dextrano sulfato Polietilenimina Dextrano aldehido DISOLVENTE ORGÁNICO DERIVADO HIDROFILIZADO Estrategia de estabilización válida para varias enzimas (PGA, esterasas,...) y varios soportes (p.e. Sepabeads, agarosa,...) RIGIDEZ + HIDROFILIZACIÓN = DERIVADO CON ALTA ESTABILIDAD FRENTE A DISOLVENTES ORGÁNICOS (6 órdenes de magnitud mayor con respecto al derivado Eupergit-PGA comercial)

REACTIVACIÓN DE ENZIMAS INACTIVADAS Curso Posgrado 2012 REACTIVACIÓN DE ENZIMAS INACTIVADAS INACTIVACION DE ENZIMAS EN CONDICIONES QUMICAMENTE INERTES, disolventes, pH y temperaturas suaves. Distorsión de la estructura 3D: estructura primaria inalterada Uso de disolvente industrial Desplegamiento Urea Guanidina Replegamiento pH 7.0 25ºC Agua

Water 8M Guanidine Residual activity, (%) Time (days) Curso Posgrado 2012 REACTIVACIÓN DE ENZIMAS INMOVILIZADAS-ESTABILIZADAS TRAS INACTIVACIÓN EN DISOLVENTE Water Residual activity, (%) 8M Guanidine Time (days) Completa 24 h reactivación. 30 min reactivación Desplagamiento-replegamiento

Reactivación del derivado glioxil de la BTL Curso Posgrado 2012 INACTIVATION BY HEAT Reactivación del derivado glioxil de la BTL 8 M guanidine % actividad No guanidine Tiempo (h)