Vectores virales para usos de Terapia Génica Manel Cascalló, Ph.D. Grup de Terapia Gènica Laboratorio de Investigación Translacional Hospital Duran i Reynals

Terapia génica: definición Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad.

Terapia génica: definición DNA GEN normal RNA Proteína normal

Terapia génica: definición Ausencia de proteína DNA Proteína anormal RNA alterado GEN alterado RNA Proteína normal

Terapia génica: definición Ausencia de proteína DNA GENES:  Causantes de enfermedades  Posibles dianas terapéuticas Proteína anormal RNA alterado GEN alterado RNA Proteína normal

Terapia génica: definición Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad.  mayor especificidad de acción

Terapia génica: definición Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad.  mayor especificidad de acción  mayor potencial terapéutico, al inducir cambios fundamentales en los parámetros fenotípicos de la enfermedad

Terapia génica: avances tecnológicos Aislamiento e identificación de genes terapéuticos Desarrollo de vectores de transferencia

Terapia génica: barreras extracelulares BARRERAS DE TEJIDO * Membranas conectivas * Epitelio vascular * Membrana hemato-encefálica * Mielina PROTEÍNAS INACTIVADORAS * Proteínas séricas de carga positiva * Proteasas/nucleasas BARRERAS INMUNOLÓGICAS * Respuesta inmune cellular * Anticuerpos * Complemento

Direccionalidad de la transcripción Terapia génica: barreras intracelulares Vector-transgen Interacción Liberación DNA/ Transporte al núcleo Proteína transferida Localización transgen Direccionalidad de la transcripción

Características del vector ideal expresión prolongada del transgén inmunológicamente inerte expresión regulable selectividad hacia el tipo celular deseado capacidad del transgén a incorporar fácil producción y a títulos elevados integración baja transmisibilidad a células germinales

Vectores usados en terapia génica DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales sistemas “físicos”

Vectores usados en terapia génica DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales 2.- virales  clasificables en base a: capacidad integrativa capacidad replicativa

Vectores usados en terapia génica DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales Integrativos: retrovirus lentivirus virus adenoasociados 2.- virales  clasificables en base a: capacidad integrativa no integrativos capacidad replicativa adenovirus Herpes simplex virus

Vectores usados en terapia génica DNA “desnudo” liposomas catiónicos condensados de DNA electroporación pistolas de DNA 1.- no virales 2.- virales  clasificables en base a: capacidad integrativa vectores replicativos capacidad replicativa vectores no replicativos

Terapia génica: vectores usados en protocolos clínicos Número de protocolos 212 35,8 % 164 27,7 % 37 6,2 % 13 2,2 % 5 0,5 % 77 13,0 % 55 9,3 % 5 0,8 % 5 0,8 % Fuente: “The Journal of Gene Medicine” © John Wiley & Sons, 2001 22 3,7 %

Terapia génica: vectores usados en protocolos clínicos Número de protocolos 212 35,8 % 164 27,7 % 72,4 % 37 6,2 % 13 2,2 % 5 0,5 % 77 13,0 % 55 9,3 % 5 0,8 % 5 0,8 % Fuente: “The Journal of Gene Medicine” © John Wiley & Sons, 2001 22 3,7 %

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1.- INFECCIÓN 2.- REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1.- INFECCIÓN 2.- REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN 2.- REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales

Del virus al vector vírico: ciclo viral introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales + replicación del DNA

Del virus al vector vírico: ciclo viral introducción del genoma viral 1.- INFECCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras 2.- REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales + replicación del DNA producción de nuevos virus

Del virus al vector vírico: construcción de vectores 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y genoma viral gen temprano casete de expresión gen interés (transgén) promotor poly-A 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector

secuencias adyacentes (en “cis”) Del virus al vector vírico: construcción de vectores introducción del genoma viral: TRANSDUCCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras casete de expresión replicación del DNA gen interés (transgén) promotor poly-A producción de nuevos virus 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector secuencias adyacentes (en “cis”)

secuencias adyacentes (en “cis”) Del virus al vector vírico: construcción de vectores introducción del genoma viral: TRANSDUCCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras casete de expresión replicación del DNA gen interés (transgén) promotor poly-A producción de nuevos virus 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector expresión del transgén secuencias adyacentes (en “cis”)

Del virus al vector vírico: construcción de vectores célula normal célula “empaquetadora” (packaging) DNA del vector DNA del vector expresión del transgén expresión del transgén proteínas virales Genoma celular Genoma celular o plásmido genes virales (complementación en “trans”) producción de nuevos virus

Problemática de la construcción de vectores probabilidad de recombinación entre genomas para generación de partículas competentes para replicación (RCV) complejidad del genoma viral: desbalance de la producción en “cis” y en “trans” retención de proteínas virales en los vectores que actúan como inmunógenas toxicidad de las proteínas virales en las células empaquetadoras difícil escalado de los procesos

transcriptasa reversa Vectores retrovirales (Rv) glicoproteína de membrana LTR gag pro pol envuelta lipídica U3 R U5 U3 R U5 cápside genoma RNA att PBS y / y’ env PPT att proteasa integrasa transcriptasa reversa (progenoma: 7 a 11 Kb) casete de expresión gen interés (transgén) promotor poly-A LTR U3 R U5 U3 R U5 att PBS y / y’ PPT att

Vectores retrovirales (Rv): propiedades Capacidad máxima del inserto: 8 kb Integración al azar en el genoma huésped (progenoma) Necesidad de división celular para una transducción efectiva (excepción: familia de los lentivirus) Poco inmunogénicos Mucha experiencia clínica Ejemplos: Familia oncotrópicos: M-MLV Familia lentivirus: HIV-1, SIV

Vectores adenovirales (Ad) fibra pentón / hexón L4 L3 MLP/TL L2 L1 E1 E3 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu ITR y ITR E2B E2A E4 genoma DNA (ds) (genoma: 36 Kb) casete de expresión gen interés (transgén) promotor poly-A 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu ITR y ITR

Vectores adenovirales (Ad): propiedades Capacidad máxima del inserto: 8 kb No integración: se mantiene de forma episómica Se pueden obtener con altos títulos (>1.1013 vp/ml) Muy inmunogénicos Tropismo para células de origen epitelial, a las que infectan con alta eficiencia Altamente bio-seguros Ejemplos: Ad-2 Ad-5

origen de replicación de HSV Vectores derivados de Herpes simplex (HSV) Elementos repetidos invertidos flanqueantes a b c Ul : “unique long” Us : “unique short” cápside proteína del tegumen envuelta lipídica glicoproteína genoma DNA (ss) (genoma: 152 Kb) vectores tipo “amplicones” vectores derivados del genoma entero locus de las proteínas “immediate early” gen interés (transgén) promotor poly-A origen de replicación de HSV a b b a a c c a y gen interés (transgén) promotor poly-A

Vectores derivados de Herpes simplex (HSV): propiedades Capacidad máxima del inserto: hasta 30 kb Se mantienen en forma de ciclo lisogénico (infección latente) Dan lugar a una expresión del transgén prolongada Tropismo para células neuronales Poca experiencia clínica Ejemplos: HSV-1 HSV-2

Vectores derivados de virus adenoasociados (AAV) TR (145 bp) TR Rep Cap (genoma: 5,1 Kb) casete de expresión TR (145 bp) TR promotor transgén poly-A

Vectores derivados de virus adenoasociados (AAV): propiedades Capacidad máxima del inserto: 4,5 kb Integrativos al azar Dan lugar a una expresión del transgén prolongada (hasta 2 años) Forman concatenámeros, lo que permite augmentar el tamaño del inserto que pueden contener Poca respuesta inmunológica Bio-seguros Ejemplos: AAV-2 AAV-5

Comparación entre vectores virales PROBLEMA ALTERNATIVA retrovirus Requerimiento de división Vectores lentivirales Mutagénesis insertacional Obtención de títulos bajos Uso de proteínas de envoltorio de otros virus lentivirus Bio-seguridad Vectores híbridos con no-humanos adenovirus Alta inmunogenicidad Vectores “gutless” Direccionamiento del vector (“targeting”) Herpes simplex Toxicidad de la proteínas en “trans” en cél. empaquetadoras Nuevas delecciones Adeno-asociados Poco tamaño del inserto Uso de los concatenámeros Producción difícil

Vectores virales: nuevas estrategias (1) Vectores híbridos Vectores “mezcla” que intentan combinar propiedades de más de un vector Ejemplos: pseudo-tipado (substitución de una partícula de la cápside viral por otra de un virus distinto) Ej. vectores retrovirales con la prot G del VSV combinación de vectores adenovirales y AAV, para obtener la capacidad integrativa encapsulación de genomas retrovirales en un virus adenoviral

Vectores virales: nuevas estrategias (2) Vectores replicativos condicionales (CRV) Vectores mutantes que actúan como virus salvajes en células con determinadas características genéticas, llevando a su muerte. Utilidad en la terapia génica del cáncer Célula normal: replicación abortiva Virus mata a la célula tumoral,y se expande a las células vecinas replicación productiva: lisis celular Virus oncolítico Célula tumoral Ejemplos: Adenovirus (CRA) : ONYX-015, AdD24 Herpes virus : G207