Preservación de la estructura “Quenching” de la fluorescencia Aplicaciones biomédicas de imagen 3D por microscopía SPIM en órgano completo María Teresa Lorrio1, 2, Imke Nerhoff1, Jorge Ripoll1, 2, Manuel Desco1, 2,3 and María Victoria Gómez-Gaviro1, 3 1 Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón. (IiSGM), Madrid, Spain, mdesco@hggm.es 2 Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, Spain 3 Centro de Investigación Biomédica en Red de Salud Mental (CIBERSAM), Madrid, Spain I. Motivación y Objetivo III. Resultados (cont.) La imagen 3D es cada vez más necesaria en la investigación translacional debido a la falta de información estructural presente en la microscopía habitualmente empleada. Objetivo: Obtener mediante “Single Plane Illumination Microscopy” (SPIM) imágenes 3D de órganos completos o tejidos previamente clareados que por su opacidad y gran tamaño no se pueden visualizar en microscopios standard. Hígado Sin clareado Clareado Riñón Vesícula Intestino Pulmón Cerebro Corazón Fig. 3: Optimización del método CUBIC para clarear diversos órganos y tejidos. El protocolo de clareado CUBIC varía su tiempo de incubación en función de la consistencia, estructura y tamaño del tejido. De esta forma, dada la alta composición de células musculares del corazón, este es uno de los órganos más complicados en los que obtener una alta transparencia del tejido. II. Material y métodos B A z x 405 nm 473 nm 532 nm 594 nm 635 nm M rM CL IO sCMOS (x,y,z) TL FF DO Fig.2: A: Componentes del microscopio SPIM, en el que se observan los láseres, lentes, motor y cámara. B: Área de iluminación del SPIM durante la adquisición de imagen. C: Efecto del clareado en la muestra. A la izquierda, la presencia de lípidos en la muestra no clareada produce la dispersión del láser, impidiendo así la excitación del fluoróforo y por tanto la adquisición de imagen en muestras grandes. A la derecha, la muestra ya clareada permite que el láser excite los fluoróforos, emitiendo así fluorescencia. C H&E SPIM A B Fig.4: Muestra humana de colon. A: Imagen 2D de la muestra con tinción H&E (scale bar: 50µm) y adquirido con microscopio óptico. B: Imagen 3D de la muestra de 2.6 mm de grosor, previamente clareado con CUBIC y marcado con IHC. Imagen obtenida mediante SPIM (scale bar: 500µm) en la que se ve la estructura volumétrica. A B H&E SPIM Fig.5: Aplicación clínica de imagen por microscopía SPIM para la visualización de tejido pulmonar afectado por enfisema. Las flechas verdes señalan tejido sano, mientras que las flechas rojas señalan tejido afectado. A: H&E de enfisema pulmonar. B: imagen de un stack obtenida mediante SPIM en la que se puede observar las cavidades alveolares dilatadas en el pulmón con enfisema comparado con pulmón control. Perfusión transcardíaca del animal con PFA 4%, extracción y post-fijado de órganos en PFA %. Clareado de muestras utilizando CUBIC. Immunohostoquímica de la muestras. Adquisición de imagen 3D con SPIM. Procesado de imagen con MATLAB y FIJI. III. Resultados Agente de clareado Preservación de la estructura Duración “Quenching” de la fluorescencia Referencia BABB ++ +++ + Dodt et al 2007 3DISCO iDISCO Erturk et al 2012 Scale - Hama et al 2012 CUBIC Susaki et al 2014 CLARITY Chung et al 2013 Focus Clear Imaging and Advanced Technology, 2009 IV. Conclusiones La técnica de clareado+SPIM ofrece nuevas oportunidades de estudiar tejido biológico de muestras de gran grosor con resolución celular en 3D. Esta tecnología proporciona información cuantificable que abre la posibilidad de utilizarse para fines de investigación y además como método diagnóstico que complete las técnicas clásicas de histología. Tabla 1: Características de los métodos de clareado probados. Entre los diferentes métodos de clareado probados, el protocolo de clareado CUBIC es el que tiene mejor balance entre preservación de la estructura y permanencia de la fluorescencia. Fuente de financiación: Human Frontiers Scientific Program RGP0004/2013, Red de investigación Cardiovascular (RIC), EC FP7 CIG grant HIGH THROUGHPUT TOMO and Brade, I+D Tecnologías P2013/ICE 2958. CIBER de Salud Mental (CIBERSAM).