Curso de Doctorado: Metodologías de generación y expresión de anticuerpos TEMA 5 INGENIERÍA GENÉTICA DE ANTICUERPOS. DISTINTAS FORMAS RECOMBINANTES OBTENIDAS García-Suárez MM

MANIPULACIÓN GENÉTICA DE ANTICUERPOS INMORTALIZACIÓN DE LINFOCITOS Anticuerpos monoclonales murinos Anticuerpos monoclonales humanos Respuesta inmune anti-globulina No reconocen los receptores celulares para Fc Líneas celulares inestables No pueden ser utilizados en terapia Vida media corta No hay lisis mediada por complemento No hay procesos de citotoxicidad celular INMORTALIZACIÓN DE GENES V GENOTECAS COMBINATORIALES DE ANTICUERPOS Baja eficacia

ANTICUERPOS QUIMERA Y ANTICUERPOS HUMANIZADOS No son inmunogénicos. Su obtención es relativamente compleja Reconocen los receptores celulares para Fc. Pueden dar lugar a reacciones inmunes

TÉCNICAS DE HUMANIZACIÓN DE ANTICUERPOS Recambio de CDRs o “CDR grafting” Clonación y secuenciación de las regiones VH y VL del anticuerpo murino Diseño de oligonucleótidos sintéticos con las secuencias de las 6 CDRs murinas Búsqueda de las secuencias V humanas de mayor homología Generación de modelos estructurales Mutagénesis dirigida FRs CDRs Intercambio de CDRs humanas por CDRs murinas ANTICUERPO HUMANIZADO Pérdida de afinidad

TÉCNICAS DE HUMANIZACIÓN DE ANTICUERPOS Remodelado o “Resurfacing” REMODELADO POR CONSENSO Los residuos expuestos se comparan con el conjunto de residuos en la superficie de secuencias humanas. Residuos poco representados en las secuencias humanas (menos del 5%) se seleccionan para mutagénesis. REMODELADO POR HOMOLOGÍA Comparación de secuencias para encontrar las secuencias humanas más homólogas. Los residuos expuestos que difieren se seleccionan para mutación. aminoácidos mutados aminoácidos mutados

FRAGMENTOS RECOMBINANTES DE ANTICUERPO Fab, scFv (single-chain antibody), dsFv (disulfide single-chain antibody) Pueden ser producidos en bacterias. Su pequeño tamaño facilita el paso a través de los tejidos.

FRAGMENTOS DE ANTICUERPO BIVALENTES Y BIESPECÍFICOS diabody D scFv monovalente A scFv bivalente B scFv bivalente y biespecífico C scFv bivalente, biespecífico + estable E dsFv-dsFv´ biespecífico linker

UTILIZACIÓN DE ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS EN TERAPIA Reclutamiento de las IgG del suero. Lo que da lugar a la activación de una serie de funciones: reclutamiento del complemento, activación de linfocitos T citotóxicos, fagocitosis, presentación de antígeno, etc. Reclutamiento de linfocitos T citotóxicos. En presencia de anticuerpos biespecíficos frente a CD3 y un antígeno celular son capaces de lisar específicamente las células portadoras del antígeno diana. Efecto sinérgico o cooperativo de la inmunoterapia combinada. Permite centrar las dos rutas del sistema inmune en una misma célula diana. Activación de linfocitos T en reposo. Se activan por unión de CD28 con el receptor B7 de la células presentadoras de antígeno.

ESTABILIDAD DE LOS ANTICUERPOS RECOMBINANTES Fc incrementa la persistencia en el suero, protegiendo el anticuerpo del metabolismo hepático. Esto mejora la unión al antígeno diana, pero no mejora la especificidad. Fc une células a través de receptores y puede dar lugar a efectos tóxicos secundarios debido a una sistémica activación de las células efectoras del sistema inmune. Fragmentos de anticuerpo sin Fc Buena especificidad. Moléculas de 25-50 kDa. Son rápidamente eliminadas del organismo por filtración glomerular en el riñón en 30-60 min. Son excelentes para diagnóstico pero no para terapia. Fragmentos de anticuerpo con Fc Construcción de bloques con dos especificidades en forma de scFv, scDb o Fab, de manera que cada especificidad se une a su antígeno diana y se forman homodímeros a través de la región Fc. Aumento del peso molecular hasta 80 kDa para evitar la rápida filtración incluyendo dominios constantes de inmunoglobulinas.

ANTICUERPOS RECOMBINANTES MULTIVALENTES Y MULTIESPECÍFICOS Se obtienen por fusión con proteínas que forman multímeros. La ventaja principal de este tipo de moléculas es un aumento importante de la avidez y por consiguiente disminuye la constante de disociación del antígeno, Kd. scFv´s Hélices de leucina antígeno scFv Tetrámero de estreptavidina

ANTICUERPOS RECOMBINANTES FUSIONADOS CON ENZIMAS ADEPT (ANTIBODY DIRECTED ENZYME PRO-DRUG THERAPY) Taxol, epotilones y otros, son una nueva clase de productos naturales que actúan como antineoplásicos debido a su capacidad para bloquear los microtúbulos, dando lugar a parada mitótica y consiguiente muerte celular. Usar anticuerpos como vectores para enzimas capaces de activar un precursor no tóxico de una droga en un potente agente citotóxico. Los fragmentos de anticuerpo se clonan como fusión con ß-D-glucoronidase, ß-lactamasa, carboxipeptidasas, etc,

INMUNOTOXINAS Fab-PE38 scFv-PE38 Las inmunotoxinas se obtienen por fusión de anticuerpos a proteínas tóxicas. Generadas mediante ingeniería genética son más homogéneas que obtenidas por conjugación química, además debido a su menor tamaño alcanzan con mayor facilidad el interior de tumores sólidos. PE38 Fab scFv Fab-PE38 scFv-PE38 BL22 es una inmunotoxina obtenida por fusión de un anticuerpo dirigido frente al receptor CD22 con la porción PE38 de la exotoxina A de Pseudomonas- CD22 se expresa de forma normal en linfocitos B maduros y se sobreexpresa en algunas leucemias. BL22 se une a CD22, entra en la célula por endocitosis y posteriormente pasa al citosol, produce ADP-ribosilación del factor de elongación y por consiguiente la muerte celular. Otras toxinas utilizadas se obtiene de plantas como la ricina, lectina o saporina

INMUNOADHESINAS E INMUNOLIGANDOS Las inmunoadhesinas están formadas por la región Fc de un anticuerpo fusionada con una hormona o un receptor. AMEVIVE = Fc de IgG1 + CD2-binding domain of LFA-3. Es un inmunosupresor que reduce el número de linfocitos T. Soriasis. EMBREL = Fc de IgG1 + parte de P75 (receptor de TNFα). Actúa como un inhibidor del TNFα que se produce durante los procesos de artritis reumatoide. Los inmunoligandos son un tipo de inmunoadhesinas en las que la adhesina es una citocina. El potencial clínico de citocinas para modular las reacciones del sistema inmune es muy alto. Sin embargo, la mayoría tienen una vida media en el suero extremadamente corta. La fracción Fc aumenta su persistencia en circulación.