Imagen 3D de la cito-arquitectura cardiaca Imke Nerhoff1, Teresa Lorrio1, 2, Jorge Ripoll1, 2, Manuel Desco1, 2,3 and María Victoria Gómez-Gaviro1, 3 1 Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón. (IiSGM), Madrid, Spain 2 Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, Spain 3 Centro de Investigación Biomédica en Red de Salud Mental (CIBERSAM), Madrid, Spain I. Motivación y Objetivo Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en el mundo [1]. El infarto de miocardio va acompañado de cambios en la vasculatura y del remodelado del miocardio. Objetivo: Análisis tridimensional de la microvasculatura cardiaca en corazón completo murino tras infarto de miocardio. Fig.1: Izda. Corte coronal de corazon sano. Dcha. corte coronal de corazon con infarto. 2007 Terese Winslow Día 0: Perfusión y postilación Día 1-5: Inmersión en CUBIC-reagent-1 Día 5: Lavados en PBS Día 5-6: Inmersión en CUBIC-reagent-2 II. Material y Métodos III. Resultados (cont.) Sin clarear CUBIC BABB 500 nm 3 μm A D G B E H Fig. 2: Clareado de corazón de ratón con método CUBIC. Protocolo optimizado y vista de los corazones clareados a distintos tiempos. Inyección lectina-647 intravenosa para marcar vasculatura. Fijación de tejidos: perfusión transcardiaca con PFA 4%. Extracción de corazón y clareado con CUBIC [2]. Sección en lonchas para adquisición de imagen por microscopía confocal. Análisis histológico tras clareado con Hematoxilina-Eosina (H&E) y microscopía electrónica. Adquisición de imagen 3D con “single plane illumination microscopy” (SPIM). Procesamiento de imagen con ImageJ y Matlab. C F I 40x Fig. 4: Efecto de clareado con CUBIC y BABB sobre la estructura celular y subcelular. Columna izquierda: tinciones de Hematoxilina & Eosina de tejido cardiaco sin clarear (A), clareado con CUBIC (B) y con BABB (C) a 40x. Comparado con (A) se observa expansión celular en (B) y una destrucción del tejido en (C). Columna central y derecha: imágenes de microscopia electrónica. En el tejido clareado con CUBIC (E) y (H) se observe una perdida de contraste (flecha azul membranas y flecha rojo mitocondrias) comparado con el control (D) y (G). El tejido clareado con BABB (F) e (I) muestra un tejido irregular con huecos visibles (flecha naranja). III. Resultados Sin clarear Clareado A B B.1 Fig. 5: Imagen 3D con resolución celular de la vasculatura cardiaca. Marcaje de la macro- y microvasculatura tras la perfusión con lectina -647 (A). Reconstrucción 3D de la microvasculatura en alta resolución en (B y B.1). Scale bars: 100µm. [4] Fig. 3: El clareado del tejido cardiaco con CUBIC permite visualizar hasta 600 micras de profundidad con microscopia confocal [3]. Azul: DAPI; Rojo: CD31. IV. Conclusiones Hemos optimizado el método de clareado CUBIC que nos permite visualizar el tejido cardiaco hasta 600 micras de profundidad por microscopía confocal. El clareado de tejido cardiaco con CUBIC combinado con microscopia SPIM nos permite obtener Imágenes 3D de corazón completo de ratón con resolución celular. Además el marcaje con lectina-647 nos permite analizar la vasculatura cardiaca en imagen 3D. Fuente de financiación: Human Frontiers Scientific Program RGP0004/2013, Red de investigación Cardiovascular (RIC), EC FP7 CIG grant HIGH THROUGHPUT TOMO, Brade, I+D Tecnologías P2013/ICE 2958, CIBER de Salud Mental (CIBERSAM Referencias: [1] Petersen, J.W et al., Microvascular coronary dysfunction and ischemic heart disease: Where are we in 2014? , Trends Cardiovasc. Med. 25(2), 98–103, 2015 [2] E. A. Susaki et al., Advanced CUBIC protocols for whole-brain and wohole-body clearing and imaging, Nature Protocols, vol. 10, no.11, 2015 [3] I. Nehrhoff et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper, Biomedical Optics Express, Vol. 7, Issue 9, pp. 3716-3720, 2016 [4] I.Nehrhoff et al. Looking through the heart: a see-through view of the vascular tree , sometido