Desarrollo de estudios independientes de cultivos de un microbiota. A Desarrollo de estudios independientes de cultivos de un microbiota. A. El DNA se extrae directamente de una muestra de un hábitat corporal humano asociado con una comunidad microbiana. Se recopilan la localización precisa de la comunidad y los datos clínicos relevantes del paciente. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar porciones de los genes de rRNA de las subunidades pequeñas (SSU) (p. ej., los genes que codifican al rRNA 16S bacteriano) que contienen una o más regiones variables. Se diseñan cebadores con códigos de barras específicos para la muestra y con corrección de error, para reconocer las regiones más conservadas del gen del 16s rRNA que flanquean la región (o regiones) variable blanco. B. Los amplicones con códigos de barras de múltiples muestras (comunidades 1-3) son agrupados juntos y secuenciados en serie en un secuenciador de DNA de siguiente generación con gran paralelismo. C. Las lecturas resultantes son entonces procesadas, con códigos de barras que denotan la muestra de la que procede la secuencia. Después de remover in silico las secuencias con códigos de barras, se alinean las lecturas y se agrupan de acuerdo con un nivel específico de identidad compartida; por ejemplo, secuencias que comparten ≥ 97% de la identidad de la secuencia de los nucleótidos se considera que representan especies. Una vez que las secuencias son codificadas de caracteres binarios a unidades taxonómicas operacionales (OTU, operational taxonomic units), se colocan en un árbol filogenético de todas las bacterias conocidas y se infiere su filogenia. D. Las comunidades se pueden comparar mutuamente por métodos basados en taxa, en los que no se considera a la filogenia y simplemente se califica el número de taxa compartidos, o mediante métodos filogenéticos, en los que se considera la similitud de la comunidad, considerando las relaciones evolutivas de los miembros de la comunidad. La métrica UniFrac se utiliza comúnmente para comparaciones basadas en la filogenia. Se muestran en ejemplos estilizados (i), (ii) y (iii) comunidades con distintos grados de similitud. Cada círculo representa una OTU coloreada con base a su comunidad de origen y colocada en un árbol filogenético maestro que incluye todos los linajes de todas las comunidades. Las ramas (líneas horizontales) son coloreadas con cada comunidad que contiene miembros de esa rama. Los tres ejemplos varían en la longitud de la rama compartida entre las OTU de cada comunidad. En (i), no hay longitud de rama compartida y por tanto las tres comunidades tienen una puntuación de similitud de 0. En (ii), las comunidades son idénticas y se asigna una puntuación de similitud de 1. En (iii) hay un nivel de similitud intermedio: las comunidades representadas en rojo y verde comparten más longitud de la rama y por tanto tienen una puntuación de similitud mayor que rojo en comparación con azul o verde en comparación con azul. La longitud de la rama compartida en cada comparación por pares de la comunidad proporciona una matriz de distancia. E. Los resultados de las matrices de distancia basados en filogenia o en taxones se pueden visualizar mediante análisis de coordenadas principales (PCoA, principal coordinates analysis) que grafican cada comunidad en el espacio de forma que el componente más grande de la varianza se captura en el eje de las x (PC-1) y el segundo componente más grande de la varianza se muestra en el eje de las y (PC-2). En el ejemplo mostrado, se comparan las tres comunidades del ejemplo (iii) del panel D. Observe que para la secuenciación del DNA de toda la comunidad (análisis del microbioma), las lecturas se comparan con genes que están presentes en los genomas de microbios cultivados y secuenciados o con genes que han sido anotados mediante esquemas de clasificación funcional jerárquica en varias bases de datos, como la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), o con ambas estrategias. Entonces las comunidades se pueden comparar con base en la distribución de los grupos funcionales en sus microbiomas (una estrategia análoga a los métodos basados en taxa para las comparaciones basadas en rRNA 16S) y los resultados se grafican con PCoA. De: El microbioma humano, Harrison. Principios de Medicina Interna, 19e Citación: Kasper D, Fauci A, Hauser S, Longo D, Jameson J, Loscalzo J. Harrison. Principios de Medicina Interna, 19e; 2016 En: http://harrisonmedicina.mhmedical.com/DownloadImage.aspx?image=/data/books/1717/harrison_ch86e_fig-86-01.png&sec=147728396&BookID=1717&ChapterSecID=114913448&imagename= Recuperado: October 06, 2017 Copyright © 2017 McGraw-Hill Education. All rights reserved