Química Biológica Patológica GALACTOSEMIA 2017 Tema:9 (Bolilla 9)  Dra. Silvia Varas svaras@unsl.edu.ar

TEMA 9: Galactosemia. Manifestaciones clínicas. Metabolismo de la galactosa en la galactosemia. Defectos enzimáticos. Metabolito tóxico. Diagnóstico. Prevención. Detección de portadores. Fructosuria. Metabolismo de la fructosa. Fructosuria esencial. Intolerancia hereditaria a la fructosa. Cuadro clínico. Mecanismo bioquímico. Diagnóstico.

Origen de Galactosa Leche  Ligada con enlaces tipo  en ciertas legumbres, verduras y frutas.  En forma de galactocerebrósidos y gangliósidos en algunas vísceras de animales

80% Vía Glicolítica 20% GPr y GLp Glucosa-6-Fosfatasa Glucosa-6- Deshidrogenasa GLUCEMIA SANGRE Via de las Pentosas   D-Ribosa-5-P +NADPH + CO2 Via Glicolitica  Piruvato   Acetil CoA Ciclo Krebs   CO2+ H2O

Vías de Metabolización de la Galactosa  Vías de Metabolización de la Galactosa 

Vías de Metabolización de la Galactosa

(1906–1987), Premio Nóbel, 1970

Papel de los UDP-azucares: “por su descubrimiento de los nucleótidos de azúcar y su rol en la biosíntesis de carbohidratos” Papel de los UDP-azucares: en los mamíferos, la mayoría de los grupos glucosilos son donados por UDP-azúcares

Metabolismo Normal Galactosa: Vía Leloir

VIAS ALTERNATIVAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA Reducción a galactitol Oxidación a galactonato La “vía de la pirofosforilasa” y bypass de GALT

Desarrollo de cataratas galactitol Desarrollo de cataratas Aldosa Reductasa (AR) “vía de la pirofosforilasa” UDP-Gal Dieta -D-galactosa Gal-1-P Glu-1-P UDP-Glu Vía Glicolítica GALK GALT GALE ATP ADP UGP (Pirofosforilasa) (3) (4) UTP PPi + UTP (1) (2) IMPasa galactonato Vía de las Pentosas Galactosa Deshidrogenasa (GDH) Acido D-Galactónico Acido -ceto-D-Galactónico  D-Xilulosa  D-Xilulosa Fosfato  Via de las Pentosas Fosfato  CO2 UTP-glucosa/galactosa pirofosforilasa IMPasa: Inositol Mono Fosfatasa

PRODUCCION ENDOGENA DE GALACTOSA ANTE UNA DIETA LIBRE DE GAL Galactosa es un monosacárido esencial? PRODUCCION ENDOGENA DE GALACTOSA ANTE UNA DIETA LIBRE DE GAL UTP-glucosa/galactosa pirofosforilasa” Inositol monofosfatasa (IMPasa)

Producción Endógena de Galactosa Vía Glicolítica Producción Endógena de Galactosa UGP (UTP-glucosa/galactosa Pirofosforilasa) (1) (2) (3) IMPasa UTP + Glu-1-P ADP ATP GALK GALT Dieta -D-galactosa Gal-1-P UDP-Gal UDP-Glu GALE

DESORDENES HEREDITARIOS DEL METABOLISMO GALACTOSA Galactoquinasa (GALK) (Tipo II) Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) (Tipo I) Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa (GALE) (Tipo III)

Galactosemia Clásica David J. Timson: The molecular basis of galactosemia — Past, present and future. Gene 589 (2016) 133–141

Galactoquinasa (GALK) El gen GALK1 se encuentra en el brazo  largo (q)  del cromosoma 17 en la posición 24 La enzima se expresa en hígado, GR, leucocitos, fibroblastos, placenta y varios tejidos fetales y adultos en humanos El dominio N terminal de la enzima monomerica se muestra en azul y el dominio C-terminal en rojo. Se muestra el sitio activo donde se une galactosa y fosfato inorgánico

Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) El gen que codifica GALT esta localizado en el cromosoma 9p13 y tiene una extensión de 4,3Kb, constituido por 11 exones. Las dos subunidades del dímero de la enzima se muestran en color rojo y azul. Se indica la posición de los metales en formas de esferas. En el sitio activo de la enzima se encuentra unido UDPglucosa. Tiene regulación dietaria y hormonal Se expresa en hígado, ID, ovarios, cerebro, fibroblastos y eritrocitos

Gen GALT 3’ 5’ Exón: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tamaño 82 170 76 49 130 57 123 133 83 155 78 (nt) 4,3 Kb Proteína: 379 aminoácidos

Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa (GALE) El gen GALE mapea en el cromosoma 1p36.  El gen incluye 12 exones que se extienden alrededor de 4 kb de ADN genómico Cada subunidad de la enzima dimérica se plega en dos dominios. Los dominios N y C terminal están en color azul y rojo, respectivamente. Unido al sitio activo NADH y UDP-glucosa. Se expresa en hígado, ID, fibroblastos y eritrocitos

Biología Molecular Galactoquinasa Al menos 25 mutaciones diferentes han sido identificados en los lugares de GALK galactoquinasa en pacientes.  Frecuencia: 1/214.470 La enzima humana incluye 392 aminoácidos con una masa molecular de 42 kDa Algunas de las mutaciones son: 1569CT en el exón 2 (R68C), 7093CT en el exón 6 (T 288M), 7538GC en el exón 8 (A384P) y una deleción  de un par de bases en el exón  5 (2833del C).

Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa Las 6 mutaciones más comunes p.Q188R, p.S135L, p.K285N, p.L195P, p.T138M y p.Y209C son el 80% de los casos de galactosemia clásica. Una 7ª mutación IVS 2-2 AG ha sido descrita en la población hispana. Mutación N314D: Variantes

Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa (GALT) Frecuencia: Galactosemia Clásica: 1:42.894 Deficiencias Parciales: 1:14.623

VARIANTES ALELICAS DE GALT

La variante Duarte es un alelo polimorfico del gen GALT que resulta en actividad alterada de la enzima. Este polimorfismo común en la población es sin signos clínicos o síntomas

Deficiencia de GALT: Alelos Duarte: La mutación N314D esta asociada con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de GALT alterada pero con fenotipos subclínicos diferentes. Duarte-1 (Los Angeles) Esta asociado con aumento de la actividad de GALT (110-130% de lo normal) N314D esta en un desequilibrio de ligamiento con la sustitución silenciosa L218L (c.652CT). La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7 Duarte-2 (D2) Esta asociado con disminución de la actividad de GALT El polimorfismo N314D es un ligamiento en desequilibrio con 3 sustituciones intrónicas (IVS 4nt-27gc; IVS 5nt-24ga y IVS 5nt+62ga) y una deleción de 4pb en el promotor de GALT La frecuencia de los alelos D2 es de 5,1

Promotor gen GALT El promotor GALT presenta un sitio AP-1 desde −126 a −119 bp (TCAGTCAG) y dos motivos E-box desde −146 a −141 bp (CAGGTG) y desde −117 a −112 bp (CACGTG). La deleción −119 a −116 GTCA remueve los dos primeros nt del motivo E-box.

Para la genotipificación: Se consideran como genotipo D2 a los individuos con al menos una copia de N314D y una copia de la deleción de 4 pb y Presenta el genotipo D1 al individuo que presente al menos una copia de N314D y ausencia de la deleción de 4 pb

Relación Genotipo/Fenotipo El Alelo Duarte puede tener significancia clínica con otras mutaciones en el gen GALT, llamadas galactosemia DG (genotipo Duarte/Galactosemia). La combinación de una mutación clásica (G) y la variante D muestra una disminución de la actividad de GALT pero no resulta típicamente en los síntomas de galactosemia clásica

Tabla II: Diagnostico de sospecha de la Galactosemia I-Clínica de sospecha II- Bioquímica Inespecífica III- Bioquímica Específica A- Síntomas Tóxicos Vómitos Rechazo del alimento Depresión neurológica A- Disfunción Hepática Hiperbilirrubinemia Hipoalbuminemia Déficit complejo protrombina  GOT, GPT, GGT, LDH Acidos Biliares plasmáticos. Hipoglucemia A-Galactosuria B- Afectación oftalmo- lógica. Cataratas B- Tubulopatía proximal renal Acidosis hiperclorémica Glucosuria Aminoaciduria Albuminuria B- Aumento de galactosa en plasma C- Fracaso hepático grave Ictericia Hepato-esplenomegalia Ascitis Diátesis hemorrágica C- Aumento de Gal-1-P en eritrocitos D- Tubulopatía proximal D- Galactitol en plasma y orina

Diagnostico Bioquímico Determinación de metabolitos Determinación de actividad enzimática

Determinación de metabolitos y actividad enzimática: Gal-1-P en eritrocitos Gal TOTAL en eritrocitos Actividad Enzimática: GALT Resumen de los niveles de metabolitos Deficiencia Galactosa (Plasma u Orina) Gal-1-P (sangre) GALK Elevada Normal GALT GALE Normal - Elevada

Diagnóstico Neonatal Sistemático del Recién Nacido UMTEST GAL de SUMA:usado en CSSL

Pesquisa Neonatal: medición de Galactosa TOTAL

Pesquisa Neonatal

Gal-1-fosfato (mg/dl) Gal-1-P= Gal Total (2º) – Gal libre (1º) % Gal-1-P= [Gal-1-P] .100 [Gal Total]

TP: KIT

Determinación Enzimática Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT) en eritrocitos

Basados en la Reacción de Beutler Opción 1 Opción 2 

Ausencia NADPH – No hay decoloración del Azul de Metileno  NADPH   actividad de GALT   rapidez de decoloración de AM

SIGMA

Análisis Molecular: Detección de Mutaciones por amplificación por PCR+ER

Q188R: exon 6, Por PCR se amplifica PA: 256 bp. Mutación Q188R Mutación N314D Mutación S135L En Brasil la galactosemia tiene una frecuencia de 1:19.984 recién nacidos. Q188R: exon 6, Por PCR se amplifica PA: 256 bp. El cambio de de una A por G crea un sitio de corte para la enzima de restricción HpaI. El alelo Q188R genera dos bandas de 158 y 98 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 256pb. N314D, Duarte variant:exon 10, Por PCR se amplifica PA: 166pb La mutación genera un sitio de corte para la enzima Ava II El alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 166pb. S135L: exon 5, Por PCR se amplifica PA: 252 bp. La mutación genera un sitio de corte para la enzima TaqI en el exón 5. El alelo S135L genera dos bandas de 192 y 60 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 252pb.

(A) Q188R – exon 6 GALT gene. L, marker; lane 1, mutated homozygous (referred case); lanes 2 and 3, heterozygous (two screened cases) and lanes 4–10, homozygous wild-type allele. Q188R (+) Hpa (B) N314D – exon 10 GALT gene. L, marker; lane 4, homozygous mutated allele (referred case); lanes 1, 2, 5 and 6, heterozygous and lines 3, 7–10, homozygous wild-type allele N314D (+) AvaII After amplification, the PCR products were digested overnight at 37-C using the enzymes HpaII for exon 6, AvaII for exon 10 and TaqI for exon 5.

Patogenia I: deficiencia de GALK La deficiencia de GALK impide la fosforilación de galactosa a Gal-1-P, lo que supone un acúmulo de galactosa en sangre, y la consiguiente producción de galactonato y galactitol El acúmulo de galactitol produce edema de las fibras del cristalino, y una desnaturalización de las proteínas, responsable del desarrollo de la catarata.

Aumento de Galactitol Catarata nuclear “en gota de aceite” que puede tener un inicio intrauterino, en casos excepcionales

Patogenia II: déficit GALT El déficit GALT se produce un aumento de Gal-1-P eritrocitaria y de la galactosa plasmática con la consiguiente galactosuria La galactosa en exceso en el plasma es convertida en galactonato, y en galactitol.

Patogenia II: Metabolitos tóxicos Gal-1-P: - Pi y ATP   AMP deaminasa  Ac. Urico; Inhibición de enzimas. - Inhibe glu-6-fosfatasa y glucógeno fosforilasa  hipoglucemia - Inhibe la función inositol monofosfatasa  inositol en cerebro. Balance UDP-Gal / UDP-Glu:  actividad galactosil-transferasa

PiADPAMP

 ATP (40%) ADP y AMP  Pi (80%) (-) inositol monofosfatasa  inositol en cerebro. (-) actividad galactosil-transferasa

Patogenia III: déficit GALE En el déficit GALE se produce un acúmulo de UDPGal e incluso de Gal-1-P Hay un déficit en la síntesis endógena de galactosa y en la producción de galactolípidos y galactoproteínas

Determinación de metabolitos y actividad enzimática: Gal-1-P en eritrocitos Gal TOTAL en eritrocitos Actividad Enzimática: GALT Tabla VIII: Resumen de los niveles de metabolitos Deficiencia Galactosa (Plasma u Orina) Gal-1-P (sangre) GALK Elevada Normal GALT GALE Normal - Elevada

Pesquisa Neonatal Para la determinación de Fenilcetonuria y Galactosemia, el niño debe estar recibiendo alimentación láctea (materna o artificial), durante por lo menos 24 horas al momento del examen. Si el recién nacido está siendo alimentado con fórmulas especiales (enteral y/o parenteral), es necesario dejar constancia de ello por escrito, en la tarjeta recolectora

Formas de informar resultados: ?? Duarte 2/Duarte 2 (homocigota), DG??

Diciembre 2010 con un total de 643.409 RN 15 pacientes con Galactosemias Clásicas (Frecuencia 1:42.894), 44 pacientes con Deficiencias Parciales de GAL-T (Frecuencia 1:14.623), 3 pacientes con Deficiencias de GAL-K (Frecuencia 1:214.470) y 2 pacientes con Deficiencias de GAL-E (Frecuencia 1:321.705). Otros países: 1: 68.400

Algoritmo (Manual de Procedimientos del Ministerio de Salud de la Nación, página 57) GN DN DD (depende: D1D1, D2D2 ó D1D2??

Tratamiento La galactosa de la dieta debe ser eliminada ante la menor sospecha La ingesta diaria no debería contener nunca más de 125 mg de galactosa (frente a los 6.500 mg que por término medio tiene una dieta de un adulto normal); Una dieta estricta contiene aproximadamente unos 40 mg

Alimentos lácteos La leche y todos sus derivados son la principal fuente de galactosa liberada en el intestino mediante hidrólisis de la lactosa; y por tanto deben ser excluidos de la dieta en cualquiera de sus formas. La caseína es probablemente también una fuente importante de galactosa libre, ya que 100 gr. aportan 184 mg, y una fórmula láctea cuyas proteínas sean un hidrolizado de caseína, puede llegar a tener 60-75 mg por litro.

Tabla IV: Contenidos aproximados en galactosa soluble de algunos alimentos (mg/100 gr de alimentos) Menos de 5 mg Melón, uva, pomelo, naranja, fresas Espárragos, remolacha, repollo, coliflor, apio, pepino, berenjena, espinaca, lechuga y maíz. Entre 5-10 mg Manzana, banana, pera. Brócoli, zanahoria, cebolla, nabo. Entre 10-20 mg Kivi, sandia, piña. Col de Bruselas, calabazas, sandia, batata. Entre 20-30 mg Arándano Tomate Entre 30-50 mg Soja, alubias Más de 100 mg Lentejas, guisantes, porotos Más de 400 mg Higos secos, pasas, avellanas Garbanzos

Control del tratamiento: Los marcadores utilizados para el seguimiento del tratamiento dietético son los niveles de Galactosa-1-P eritrocitarios, y galactitol plasmático. Valores de 4 mg % de Gal-1-P, y de Valor máximo aceptable 25-30 mol/L de galactitol plasmático (mg/dl =38 x mol/L).

Resultado Pesquisa Neonatal  gal y enzima GALT o  gal y GALT: N GALT< 1%  Gal-1-P GALT 1-10%  Gal-1-P GALT 10-75% N/ Gal-1-P GALT: N  Gal Gal-1-P: N GALT: N  Gal-1-P Mutación GALT presente Mutación GALT presente Mutación GALT presente Galactitol Normal Galactitol Galactitol  Actividad GALK  Actividad GALE Variante/ Galactosemia Benigna o Portador Galactosemia Clásica Deficiencia GALK Falso Positivo Deficiencia GALE Variante de Galactosemia

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