El complejo TcCyP19-CsA se une a la calcineurina humana in vitro Estudios funcionales de la ciclofilina de 19 kDa de Trypanosoma cruzi con células y proteínas de mamífero. Jacqueline Búa1,2,3, Alina E. Perrone1,3, Noelia L. Grosso1,3, M. Cecilia Albareda1,2, Mariana Potenza1, Laura E. Fichera1,2,3 y Alicia G. Fuchs1,3. Instituto Nacional de Parasitología Dr. M. Fatala Chaben 1, CONICET 2, CAECIS, Universidad Abierta Interamericana 3. Introducción: La Ciclosporina A (CsA) se une a una clase de chaperonas denominadas ciclofilinas (CyP). El complejo CyP-CsA interactúa con la calcineurina (Cn), la inhibe por secuestro y bloquea la proliferación de los linfocitos T, estableciendo una inmunosupresión en mamíferos. Previamente, hemos descripto la acción parasiticida de la CsA y derivados sobre el T. cruzi, tanto in vitro como in vivo. Además, caracterizamos 15 genes que codifican para ciclofilinas, y que cuatro de ellos se expresan en el estadío epimastigote como proteínas de unión a ciclosporina. La isoforma TcCyP19 fue la más expresada en epimastigotes, localizada mayoritariamente en el citoplasma. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la relación de esta proteína parasitaria, TcCyP19, con el hospedador en cuanto a su secreción al medio circundante, a su capacidad de interactuar con otras células y formar complejos con proteínas del mamífero. Materiales y Métodos: Resultados: WT kDa 21 31 43 60 97 Epis Medio La TcCyP19 se secreta al medio de cultivo y la secuencia amino terminal le serviría como péptido señal. Inmunoblotting: Los epimastigotes salvajes del clon CL Brener de T. cruzi o transfectados (ver más abajo) fueron separados por electroforesis en SDS-PAGE y se electrotransfirieron a membranas de nitrato de celulosa. Las membranas bloqueadas se incubaron con el anticuerpo primario, anti-TcCyP19 o anti-GDH, gentilmente cedido por la Dra. Vilma Duschak, y revelado con sustrato para peroxidasa. Epimastigotes Transfectados con TcCyP19pAff: Esta proteína está codificada por el gen de la TcCyP19 fusionado a un segmento peptídico amino terminal que le confiere el doble de peso molecular que el que posee la forma nativa. El plásmido recombinante pRibotex conteniendo la secuencia de fusión TcCyP19pAff se utilizó para transfectar epimastigotes del clon CL Brener de T. cruzi y los parásitos transfectados estables se seleccionaron con el agregado de Geneticina 250 µg/ml. T M E GDH M E Western blot: Lisado de epimastigotes (Epis) y Sobrenadante de medio cultivo (Medio) revelados con anti-TcCyP19 y anti-Glutamato deshidrogenasa (GDH). WT: epimastigotes de tipo salvaje. T: Epimastigotes transgénicos, que expresan una proteína de fusión denominada TcCyP19pAff. Esta proteína recombinante no se secreta al medio de cultivo. La TcCyP19 marcada con fluoresceína interactúa con células de mamífero. Se marcó la TcCyP19 con fluoresceína y la proteína se purificó del isotiocianato de fluoresceína libre por columna de exclusión molecular (Bio-Gel P6). Se marcaron 5x105 células VERO con 3 microgramos de la ciclofilina marcada en PBS a 37°C durante dos horas. Luego se lavaron por centrifugación con PBS. Se adquirieron 50.000 células/muestra en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton-Dickinson). El análisis de los datos obtenidos se realizó mediante el programa FlowJo version 4.2 (Tree Star, San Carlos, Ca, USA). A: Células VERO control incubadas a 37°C. B: Células VERO incubadas a 37°C con 3 ug TcCyP19. Se observa un 27 % de células marcadas. C: Se preincubó 3 ug TcCyP19 con un anticuerpo de conejo anti-TcCyP19 durante 30 min. Luego se incubó como en B. Se observó un 19 % de células marcadas con fluoresceína. D: Se preincubó 3 ug TcCyP19 con 1 micromolar Ciclosporina A. Luego se incubó como en B. Se observó un 14 % de células marcadas con fluoresceína. Los datos obtenidos sugieren una interacciòn de la TcCyP19 con la célula VERO parcialmente inhibida por anticuerpos específicos o por su molécula inhibidora, la Ciclosporina A. A: Células Vero B: Cél Vero + TcCyP19 C: Cél +CyP19+Anticuerpo D: Cél +CyP19+Ciclosporina A El complejo TcCyP19-CsA se une a la calcineurina humana in vitro Actividad in vitro de la calcineurina humana: Para evaluar si el complejo formado por la TcCyP19 recombinante y la CsA podía establecer una unión con la calcineurina humana, se realizó un ensayo in vitro con un kit comercial de inhibición de la actividad fosfatasa. Se midió por colorimetría la liberación de grupos fosfatos por acción del fosfopéptido RII por la actividad fosfatasa de la calcineurina en presencia y ausencia del complejo TcCyP19-CsA. Dado que la calcineurina es una fosfatasa clasificada como del tipo PP-2B, se utilizó EGTA como agente quelante para corroborar que la absorbancia generada por los grupos fosfato liberados sea específica de la calcineurina (PP-2B). De esta forma distinguimos entre la absorbancia debida la acción fosfatasa de la calcineurina de la debida a todas las fosfatasas que pueden estar presentes en la mezcla de reacción (PP-1, PP-2A, PP-2B y PP-2C). El ácido Okadaico inhibe la acción de las fosfatasas PP-1 y PP-2A. En presencia únicamente de TcCyP19 el agregado de EGTA a la mezcla de reacción disminuyó la absorbancia con respecto del control al inhibir específicamente la actividad de la calcineurina. La incubación con ácido Okadaico mostró la actividad de la calcineurina y PP-2C. En presencia conjunta de TcCyP19 y CsA, disminuyó significativamente la absorbancia generada por la liberación de grupos fosfato respecto de la incubación con el agregado de EGTA ni de okadaico a la mezcla de reacción. Esto es debido a que la unión de la TcCyP19, mediada por la CsA, inhibió la actividad fosfatasa de la calcineurina, lo que implica la formación del complejo tripartito TcCyP19-CsA-Calcineurina humana. TcCyP19 TcCyP19 + CsA Acción inhibitoria de la actividad fosfatasa de la calcineurina por la presencia del complejo TcCyP19-CsA. El gráfico muestra la disminución de la absorbancia a 620 nm (indicador de la liberación de grupos fosfato debido a la actividad fosfatasa de la calcineurina), en presencia del complejo TcCyP19-CsA. Total: actividad de fosfatasa total debido a PP-1, PP-2A, PP-2B y PP-2C, sin el agregado de EGTA ni de Acido Okadaico. A la izquierda: actividad fosfatasa de la mezcla de reacción en presencia de TcCyP19 e inhibidores. A la derecha: actividad fosfatasa en presencia de TcCyP19 + CsA e inhibidores. En CONCLUSION La ciclofilina de 19 kDa del Trypanosoma cruzi, TcCyP19, se secreta al medio extracelular, interactúa con células VERO y establece un complejo con la calcineurina, una proteína humana, in vitro. Estos resultados alientan el estudio de la función de esta proteína parasitaria en el hospedador mamífero.