Presentado por: Dra. Irene A. Gómez Espinel HLA como un ejemplo de pruebas diagnòsticas en biologìa molecular Presentado por: Dra. Irene A. Gómez Espinel UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA CLÍNICA 2006

El ADN y su duplicaciòn

Componentes del ADN: Azúcar Bases Grupo fosfato

Azùcares

Bases nitrogenadas

Complementariedad de las bases

Bases nitrogenadas NUCLEÓSIDO Nucleótidos A Adenina desoxiadenosina dAMP dATP desoxiadenosín trifosfato T Timina desoxitimidina dTMP dTTP desoxitimidín trifosfato G Guanina desoxiguanisina dGMP dGTP desoxiguanosín trifosfato C Citosina desoxicitidina dCMP dCTP desoxicitidín trifosfato U Uracilo

DUPLICACIÒN DEL ADN

APLICACIÓN

Tipificación En el Laboratorio de Biología Molecular del departamento de patología clínica del HU. A partir de ADN obtenido de sangre periférica. La tipificación de los genes HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-DR).

Obtención de la muestra

EXTRACCIÓN DE ADN

ADN

Comprobación cualitativa de la presencia de ADN

Comprobación cualitativa de la presencia de ADN

Comprobación cuantitativa de la presencia y pureza del ADN FORMULA: Ng/µl de ADN = (D.O 260 nm)(Factor de dilución)(50) Factor de dilución = volumen total de la celda (1005)/ volumen de muestra (5 µl) = 201 50 = factor para ADN de doble cadena 35 = factor para ADN de cadena sencilla 40 = factor para ARN

Reacciòn en Cadena de la Polimerasa (PCR)                                               Técnica de laboratorio simple y rápida de amplificación del ADN que hace posible obtener múltiples copias y la identificación de secuencias específicas de ADN por medio de ciclos repetitivos utilizando el termociclador 1983

Historia de la PCR 1983 Kary Mullis Inventa la PCR 1985 Primera publicación científica 1986 Cetus corparation y Perkin Elmer inician desarrollo de reactivos e instrumentos para PCR 1988 Se publica el uso de la Taq para PCR (Saiki et al) 1990-1993 Batalla de las compañías por los derechos de fabricación de reactivos. 1993 Kary Mullis recibe el premio Nobel en Química.

Componentes de la PCR DNA molde concentración de 25-200 ng/ml. Iniciadores. (oligonucleotidos, primers, Cebadores). dNTP´S. (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) DNA Polimerasa termoestable. (Taq, Tli, Pfu) Reguladores (Mg+2) Ciclos de temperatura (Termociclador)

Termocicladores

PCR: pasos y ciclos

Pasos de la PCR 1.- Desnaturalización del DNA (95 0C)

Pasos de la PCR 2.- Hibridación del Iniciador (50-70 0C)- Alineamiento

Pasos de la PCR 3.- Polimerización (72 0C)

Ciclos de la PCR

PCR

Termocicladores MJ Research PTC-100 Dyad Tetrad Opticon

Tipos de PCR PCR POR GRUPOS ALÉLICOS PCR-RFLP PCR in situ RTPCR PCR en tiempo real PCR POR GRUPOS ALÉLICOS

IDENTIFICACIÒN DE ALELOS DE LOS GENES HLA-A y HLA-B EN POBLACIÒN DEL NORESTE DE MÈXICO

Sistema HLA Los Antígenos Leucocitarios Humanos – HLA: Son moléculas que se encuentran en los leucocitos y en la superficie de casi todas las células de los tejidos de un individuo. Reconocen lo propio y lo ajeno Aseguran la inmunidad.

Sistema HLA Transmitidas de padres a hijos También denominado de Histocompatibilidad Existen tres clases de antìgenos HLA I, II, III Existen tres "lugares estratégicos": HLA-A, HLA-B y HLA-DR

Cromosoma No. 6

Sistema HLA El tipo de antígeno presente en A, B y DR es lo que determina la posibilidad de aceptación del tejido de un donante por el organismo de un receptor. Para que dos personas sean compatibles, los antígenos presentes en cada uno de los tres lugares deben ser idénticos. Análisis del ADN en sangre.

Evoluciòn de los alelos

Alelos de HLA identificados al 2006 Clase I A B C E F G H J K L Total 266 511 128 6 1 15 927 Clase II DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB 3 403 23 53 20 101 4 8 629 TOTAL 2532

Genética Los genes del Sistema HLA se heredan siempre en bloque. Cada bloque se denomina haplotipo. El padre aporta un haplotipo (=mitad del genotipo) y la madre otro, dando origen al genotipo, perfil genético propio o individualidad del nuevo ser.

Genética Sistema HLA Padre Madre Haplotipo a Haplotipo b Haplotipo c Haplotipo d Hijos Combinación 1 Combinación 2 Combinación 3 Combinación 4 Genotipo a-c Genotipo a-d Genotipo b-c Genotipo b-d

Genética  a b c ac bc ad bd d 25 % ac, 25% ad, 25% bc, 25% bd 25% de posibilidades de coincidir con un hermano

Gen de HLA

PCR

ELECTROFORÈSIS Es el movimiento de partículas eléctricamente cargadas, a través de un gas, líquido y en soportes sólidos o semisólidos (geles), como resultado de un campo eléctrico formado entre los electrodos sumergidos en el medio acuoso.

Corrimiento electroforético MPM EXON 2 EXON 3 Carril de ejemplo Cátodo Apilado del gel Marco de plástico Corrimiento del gel Ánodo

Revelado de los geles Pasos a seguir: 1.- Solución fijadora 10´ 2.- Colorante AgNO3 5´ 3.- Lavar de 2 a 3 veces con H2O. 4.- Solución reveladora. 5.- Solución fijadora

Interpretación de resultados. Estos se realizan observando el DNA teñido con bromuro de etidio en un gel de agarosa.

Interpretación de resultados. Con Nitrato de plata

Enfermedades asociadas a genes HLA Espondilitis anquilosante HLA-B27 Síndrome de Reiter HLA-B27 Enfermedad celìaca y hepatitis crónica activa HLA-B8 Diabetes tipo 1 HLA-DR3 y DR4. Artritis reumatoide con HLA-DR4. Esclerosis múltiple HLA-DR2.

VENTAJAS ESTUDIO DE ADN   1.    Se puede detectar una mayor información que con la serología 2.    Los resultados pueden guardarse indefinidamente 3.    Se pueden identificar todos los componentes del sistema HLA 4.    más fiable en cuanto a la identificación de cada individuo. 5.    Más exacto ya que se eliminan reacciones cruzadas 6.    Rapidez en los resultados.

Puntos críticos en la técnica de PCR   Riesgo de contaminación: ADN de la muestra Moléculas de ADN previamente amplificadas Alto costo de los reactivos y equipo Espacio físico específico

Secuenciación automática

Secuenciaciòn de ADN

Cromosoma 6 GRACIAS