Mutaciones inestables Isabel Castro Volio MD, MSc. INISA

Sinónimos Mutaciones inestables, mutaciones dinámicas, Mutaciones por inestabilidad de repeticiones mutaciones por amplificación del ADN, mutaciones por tripletas repetidas, mutaciones por expansiones de trinucleótidos

Inestabilidad de repeticiones Tipo de mutación ligada con más de 40 trastornos Neurológicos Neurodegenerativos Neuromusculares Proceso dinámico de mutación, con productos que continúan mutando dentro de los tejidos y entre las generaciones (inestabilidad somática y germinal)

El ADN repetitivo Secuencias de ADN no codificante repetidas en tandem: Microsatélites Minisatélites Satélites Megasatélites Otras secuencias repetidas

Pequeñas repeticiones de secuencias de ADN Numerosas en el genoma Localizadas cerca o dentro de unidades de transcripción (genes) Función ? Expansiones de ciertas secuencias repetidas de nucleótidos se asocian a varias patologías hereditarias.

Tipos de microsatélites También se les llama short tandem repeats (STRs), son repeticiones desde una hasta 6 pares de bases, en tandem

Tipos de repeticiones asociadas con patología Trinucleótidos, la unidad repetida son 3 pb: Es la categoría más amplia Tetranucleótidos, 4 pb: Distrofia miotónica tipo 2 (DM2) Pentanucleótidos, 5 pb: Ataxia espinocerebelar 10 (SCA10) Minisatélites, 7-64 pb: Epilepsia progresiva mioclónica 1(EPM1), insulina (INS) Megasatélites varias kb: Distrofia muscular fascioescápulohumeral 1A (FSHND1A)

Repetición de trinucleótidos Tres nucleótidos adyacentes en el ADN. Ej. CAG: citosina, adenina, guanina. El genoma normalmente tiene segmentos con secuencias repetidas. Las tripletas son un tipo de estas secuencias. Una cantidad anormal de tripletas en algunos genes alteran la función del propio gen, de los ARNs o de sus productos proteicos, causando enfermedades del sistema nervioso o multisistémicas.

Síndrome del cromosoma X frágil

El sitio frágil se ubica en Xq27.3

Esquema de la localización de tripletas repetidas en diferentes trastornos genéticos. En rojo las regiones traducidas, en celeste las regiones 5’ y 3’ no traducidas y en azul los intrones. Adaptado de Sinden et al. 2002.

Clasificación por tipos de tripletas y localización en cada gen Amplificación CAG en una región codificante del gen respectivo: Causa un tramo largo de poliglutamina en la proteína. La proteína adquiere ganancia de función Enfermedades neurodegenerativas, progresivas, típicas de la edad madura, que causan disfunción y pérdida neuronal crecientes después de 10 a 20 años del inicio de la sintomatología. Las transmisiones paternales causan mayor inestabilidad intergeneracional Agregados de proteínas o inclusiones nucleares Expansiones de menor tamaño que sugiere que las expansiones muy grandes pueden ser letales en el embrión

Clasificación por tipos de tripletas y localización en cada gen Diferentes tripletas: CGG, GAA, CTG y GCC en regiones no codificantes de los genes respectivos: Trastornos típicamente multisistémicos, con disfunción o degeneración de muchos tejidos diferentes El tamaño y la variación de la expansión son mucho mayores que para el grupo anterior Con expansiones de tamaño intermedio, clínicamente silenciosas (premutaciones) que se pueden expandir a mutación después de la transmisión germinal Se produce inhibición parcial o completa de la expresión génica, alteración en el metabolismo de los ARNs,…

Mutaciones inestables Síndrome del cromosoma X frágil: primera causa de retardo mental hereditario 6% de la población con retardo mental moderado - severo Distrofia miotónica: principal distrofia muscular del adulto Enfermedad de Huntington, las tres enfermedades son: discapacitantes anticipación genética dominantes requieren terapia génica

Síndrome del Cromosoma X Frágil Herencia: dominante ligada al sexo Mutación: en el gen FMR1 Xq27.3 -una expansión de la tripleta CGG en el extremo 5’ no codificante -inestabilidad meiótica y somática. Individuos normales: ~ 5 - ~ 44 repeticiones CGG Alelos intermedios: ~ 45 - ~ 54 Con premutación: ~ 55 - ~ 200 / 230 Pacientes con FRAXA: ~ 201/ 230 o más repeticiones

La FMRP = 69 kD

El gen FMR1 abarca 38 kb y consiste de 17 exones. Codifica un transcripto de 4.4 - 4.8 kb que se traduce en una proteína de 614 aa. Tiene varios sitios de corte y empalme (splicing) alternativo. El exon 1 es muy rico en CG. La repetición CGG se encuentra dentro del exon 1 en la 5’UTR. 250 bp corriente abajo de la (CGG)n hay una isla CpG que cuando se metila silencia el gen.

FMRP La proteína FMRP pesa 69 kDa y se producen muchas isoformas debido al splicing alternativo. Se expresa básicamente en el cerebro, específicamente en las neuronas, y en los testículos. FMRP liga ARN selectivamente, forma un complejo de ribonucleoproteína mensajera que se asocia con los poli-ribosomas. Podría estar implicada en la regulación de la traducción a nivel de neuronas via microARNs,

FMRP es una proteína que liga ARN y se asocia con los poliribosomas en traducción como parte de una gran ribonucleoproteína mensajera (mRNP) y modula la traducción de sus ligandos al ARN. La FMRP se localiza en las sinapsis y su ausencia altera la plasticidad sináptica, la cual se implica en el aprendizaje y la memoria.

Clínica del síndrome del cromosoma X frágil Cara larga y angosta Orejas protuberantes Mentón prominente Macroorquidismo Retardo Mental Hiperactividad Rasgos autistas - aleteo y mordisqueo de las manos - no contacto visual Deficiente integración sensorial Varones 100% afectados, Mujeres < 50% afectadas.

FRAXA, cuadro clínico en varones:

El fenotipo MARTIN-BELL: Cara larga y angosta, orejas y mentón prominentes macro-orquidismo

Common Features of Fragile X Syndrome Physical • large ears • long, narrow face • prominent forehead • prominent, square chin • large testicles • high palate (roof of mouth) • hand calluses • mitral valve prolapse (a leaky heart valve) • seizures • eye problems Non-Physical • developmental delay • mental retardation • learning disabilities • hyperactivity • autistic-like features: hand biting hand flapping poor eye contact • shyness, social anxiety • mental health issues • talkativeness • rapid, repetitive speech • difficulty adjusting to change

Fenotipo en el varón

Acentuación del fenotipo

PREVALENCIA DEL SÍNDROME X FRÁGIL Se encuentran casos en todos los grupos étnicos. Afecta 1 : 4 500 varones afecta 1 : 9 000 mujeres la prevalencia de la pre-mutación es ~1 : 800 varones ~1 : 250 mujeres

Diagnóstico citogenético

Diagnóstico del cromosoma X frágil

Diagnóstico del cromosoma X frágil PCR

Síndrome del cromosoma X frágil (FRAXA) 1 : 4 000 varones Genética: - dominante ligada al Cromosoma X - amplificación CGG en el FMR1, Xq27.3 - la mutación completa tiene transmisión materna. - la amplificación causa la inactivación del gen por metilación de la región promotora. - efecto fundador - anticipación genética

Distrofia miotónica Prevalencia 1 : 8 000 en caucásicos 1 : 20 000 en japoneses 1 : 475 en Quebec, Canadá África, únicamente una familia nigeriana. En Costa Rica, desconocida por el momento.

Genética Herencia dominante con expresión variable, penetrancia incompleta y anticipación. Expansión de la tripleta CTG inestable, localizada en el extremo 3’ no traducido del gen DMPK y en la región promotora del gen SIX5 en 19q13.3 Inestabilidad meiótica y somática. Individuos normales: 5-38 repeticiones CTG Pacientes con DM: 50-1000 o más repeticiones

Gen DMPK Inicio de Traducción Fin de Traducción Tel Cen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5’ 3’ Intrón 4 Intrón 6 Exón 8 Exón 9 Normal CTG Premutaciones 5-37 rep Afectados 50-80 rep Tel Telómero 100- 2000 rep Cen Centrómero

Categorías de pacientes según tamaño de la amplificación en correlación con el fenotipo I Asintomático II Enfermedad más leve. III Expresión clásica del adulto. IV Expresión pediátrica. V Congénita > 1 500 repeticiones CTG

Cuadro clínico DM1 Atrofia progresiva músculos esqueléticos Relajación muscular afectada (miotonía) Defectos conducción  arritmias cardiacas Cataratas iridiscentes de inicio temprano Resistencia a la insulina e hiperinsulinemia Insuficiencia testicular Calvicie frontal Función alterada del SNC (trastornos cognitivos, somnolencia, trastornos del comportamiento,…)

Inestabilidad de la mutación Está directamente relacionada con el tamaño de la amplificación: -repeticiones en el ámbito normal son polimorfismos estables. - si sobrepasan el tamaño umbral de ~ 40 (DM) se vuelven inestables. Es más probable que ocurran expansiones, aunque también se ha descrito la ocurrencia de contracciones. Existe correlación negativa entre edad de expresión y tamaño de la amplificación.

Clínica de la Distrofia Miotónica Miotonía, desgaste y debilidad muscular progresiva, calvicie, cataratas, problemas respiratorios, arritmias cardiacas, atrofia testicular, resistencia a la insulina. Aparece en el adulto joven, afectando en grado variable los diferentes sistemas, acorta la vida, y es discapacitante. Existe una forma congénita con hipotonía, diplejia facial, retardo mental, defectos en la deglución y succión.

Harper,P.S. In: Genetic Inatabilities and Heredetary Neurological Disorders, p.122,1998

Distrofia Miotónica Herencia: autosómica dominante con penetrancia incompleta y expresión variable. Mutación: en el gen DMPK localizado en 19q13.3 -una expansión de la tripleta CTG en el extremo 3’ no codificante -inestabilidad meiótica y somática. Individuos normales: 5-37 repeticiones CTG Pacientes con DM: 50-1000 o más repeticiones

ANTICIPACIÓN

Enfermedad de Huntington “muecas extrañas dan un primer aviso. Luego, las personas afectadas se tornan más distraídas y comienzan a realizar gestos involuntarios, sobre todo en situaciones de estrés físico o psicológico. A medida que la enfermedad progresa, menudean movimientos como pasos de baile o tumbos de ebrio. La invalidez se hace más patente. Los enfermos se sienten incapaces de acometer las tareas rutinarias, al par que ven mermadas sus funciones intelectuales; no saben organizarse. En los estadios más avanzados aparecen la depresión y la agresividad; en los casos más graves, la demencia y la psicosis. El que antes era un miembro activo de la familia, un amigo o un compañero de trabajo vivaz se torna una sombra desvalida”. Investigación y Ciencia, febrero 2003

Enfermedad de Huntington (HD) Descrita por George Huntington en 1872 Sinónimos: Corea de Huntington, mal o baile de San Vito

Enfermedad de Huntington (HD) Enfermedad neurodegenerativa y progresiva del SNC Es uno de los trastornos hereditarios del cerebro más frecuentes Presente en todos los grupos étnicos Prevalencia: - 5-10: 100 000 en caucásicos - 0.01: 100 000 en africanos - 0.11-0.45: 100 000 en japoneses - 0.2-0.4: 100 000 en chinos -12:100 000 Tasmania (Australia) -Región de Zulia (NO Venezuela, junto al lago Maracaibo): 40% de la población está en riesgo, al menos hay 1000 personas mostrando síntomas y otros 3000 más son presintomáticos

Enfermedad / corea de Huntington Neurodegenerativa Age of onset promedio a los 40 años 10 - 15 años después sobreviene la muerte Afecta ambos sexos por igual. Afecta a todos los grupos étnicos, pero es más frecuente en europeos occidentales (1/10 000). Autosómica dominante. Expansiones de la tripleta CAG

Enfermedad de Huntington, clínica Alteraciones motoras = Corea progresiva Trastorno caracterizado por movimientos rápidos, involuntarios, inútiles, como flexionar y extender los dedos, elevar y descender los hombros o realizar muecas. Progresa hacia movimientos como danzantes que involucran todo el cuerpo. Alteraciones psiquiátricas. Deterioro intelectual, cognitivo.

Edad de manifestación HD clásica: 30 y 50 años de edad (manifestación tardía) HD infantil: < 10 años de edad (1-3%) HD juvenil (variante Westphal): < 20 años de edad (5-10%) HD inicio tardío: >50 años de edad (20%) El curso es progresivo, con una evolución media de unos 15-20 años desde el inicio de los síntomas hasta la muerte

Se afectan regiones muy específicas: empieza en el núcleo caudado, continúa expandiéndose hacia el putamen y el globus pallidus. Las neuronas dejan de funcionar y luego mueren, esta pérdida neuronal puede disminuir el peso del cerebro un 25% o hasta un 40%.

El gen de la corea de Huntington Se llama IT15 = Important Transcript 15. Abarca ~ 185 kb de ADN genómico en 4p16.3. Contiene 67 exones, la repetición CAG está en el exon 1. Dos transcriptos principales de ARNm. Codifica la proteína “huntingtina” (htt) La repetición CAG se traduce en una región de poliglutaminas que causa ganancia dominante de función.

Mutación responsable de la HD 1993: identificación de la alteración genética Expansión del trinucleótido CAG en el exón 1 del gen IT-15 ó HD, cerca del extremo 5’  segmento PoliQ:Huntingtina (htt) Exón 1 Gen IT-15 ó HD Esquema del gen IT-15 ó HD e intervalos según el número de repeticiones CAG Adaptado de Potter et al. 2004

Genética: Mutación Los cromosomas normales poseen de 9 a 35 repeticiones CAG, con una moda de 18 Los cromosomas CH poseen de 36 a 121 repeticiones CAG y la moda es de 48 Se han reconocido 4 intervalos de tamaños de repeticiones CAG asociados con riesgos variables de la enfermedad: A. Normal:  28 repeticiones B. No penetrante con inestabilidad meiótica paterna: 29 a 35 repeticiones C. Penetrancia reducida con inestabilidad meiótica paterna: 36 a 39 repeticiones D. CH:  40 repeticiones Susceptibles a expansión

Inestabilidad intergeneracional de la repetición CAG En la gametogénesis, sobre todo en la transmisión por el varón. En > 80% de las transmisiones de un padre o una madre CH, el # de CAG  o  en una o pocas unidades. A veces en una transmisión paterna el aumento en el # de repeticiones es muy grande  aparición juvenil de la CH (> 60-70 repeticiones). Mosaicismo en el tamaño de las repeticiones en los espermatozoides de los varones CH.

Enfermedad de Huntington Típicamente entre 30-40 años, a veces entre 2-90 años. Expresión juvenil asociada a transmisión por linaje paterno Casos “esporádicos”: expansiones ocurridas en las meiosis de individuos sanos de sexo masculino con 36 - 39 repeticiones. Mutaciones “nuevas” ~ 3%, surgen de alelos paternos intermedios, con 29 - 35 repeticiones. Riesgo del 50% Presenta el fenómeno de anticipación genética la huntingtina tiene función ¿?.

Ganancia de función tóxica de la htt No hay CH en deleciones del gen IT15. No hay CH en translocaciones que cortan el gen IT15. El fenotipo de los heteros y los homos es =. Fenotipo dominante. No mutaciones de ninguna clase excepto inestables. Los niveles de htt son = para alelos normales y mutados

Neuronas con inclusiones de poliglutamina Típicas en CH, SCA1, SCA3, SCA7, DRPLA, SBMA. Inclusiones de proteínas con poliglutamina + ubicuitina. Estas inclusiones correlacionan con promoción de la apoptosis. Se llaman inclusiones intranucleares neuronales (NII) pero en CH también hay inclusiones citoplasmáticas.

Mutaciones dinámicas, resumen Sexo de transmisión en la > de enf por repeticiones de CAG, + severa si es paterna, en FRAXA y en DM hay > variación de tamaño en la transmisión materna Inestabilidad somática y germinal Patrones de expresión tisular Mosaicismo y posición dentro de los genes afectados la > de las (CAG)n en región codificante, excepto SCA12 (5’UTR)