Diagnóstico Virológico Bioq. Alejandro Kuc Servicio de Inmunología - Hospital “Dr. Julio C. Perrando” Cátedra de Virología - FaCENA - UNNE Área de Inmunología - IMR - UNNE

Importancia Determinar una intervención terapéutica Definir el pronóstico en la evolución de un paciente Indicar la necesidad de una vacunación Adoptar medidas de salud pública en una comunidad: epidemiología. Tendencia: Sensibilidad y Rapidez

Métodos de Diagnóstico Directos: presencia de virus en muestras clínicas Agente infeccioso: aislamiento viral Partícula viral: microscopía electrónica Antígenos virales: inmunomarcación Genomas virales: biología molecular Indirectos: respuesta de anticuerpos específicos antivirales en el suero del paciente

Tipo de Muestras Virus respiratorios: aspirado nasofaríngeo Lesiones Cutáneas: raspado e hisopado Sangre: aislamiento viral Suero: búsqueda de anticuerpos (serología) Materia Fecal: enterovirus Orina: aislamiento de CMV LCR: enterovirus y parotiditis Muestras oculares: hisopado Tejidos: aislamiento viral o inmunohistoquímica

Transporte y conservación Aislamiento Inmediatamente (inactivación y contaminación) No congelar Conservación Temp amb: horas 4ºC: 1-2 días -20ºC: meses -70ºC: años

Métodos Directos

1- Aislamiento Viral Huevos, Animales o Células Tipos de cultivos celulares Primario: directamente del tejido humano o animal; 1-2 subpasajes Diploide: derivado del tejido fetal o de RN; 20-50 subpasajes Hetroploide: extraídas de tejido tumoral o tranformado; infinitos subpasajes Variación en susceptibilidad Es indispensable el Diagnóstico presuntivo

Inoculación e incubación (ATB) Decontaminar muestras no estériles Inocular en tubos de cultivo: 200-300 µL de muestra en medio con ATB 1 hr a 37º para permitir la adsorción Añadir medio de cultivo y cambiarlo cada 2-3 días.

Detección de los efectos de los virus Acción citopatogénica: tipo, magnitud, velocidad y cultivo

Detección de los efectos de los virus Acción citopatogénica: tipo, magnitud, velocidad y cultivo Hemadsorción

Detección de los efectos de los virus Acción citopatogénica: tipo, magnitud, velocidad y cultivo Hemadsorción Hemaglutinación

Detección de los efectos de los virus Acción citopatogénica: tipo, magnitud, velocidad y cultivo Hemadsorción Hemaglutinación Interferencia Dx presuntivo: debe confirmarse Identificación Inmunofuoresencia Imunoperoxidasa Cuantificación de virus Titulación de punto final Plaqueo bajo agarosa

2- Microscopía Electrónica Métodos Inmunoelectromicroscopía Coloración negativa Ventajas Rápido (pocas muestras) Desventajas Costo del ME Baja Sensibilidad

3- Inmunoflourescencia Técnica Directa Indirecta Ventajas Muestra estable Muy Sensible Muy Específica Rápido Desventajas Costo del MF Observador experimentado

IFI

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4- Aglutinación Ventajas Desventajas Sencillo Rápido No requiere equipamiento Desventajas Poco especifica

5- Enzimoinmunoensayo (EIA) Ventajas Muy Sensible No se necesita observador experimentado Gran numero de muestras simultáneamente Automatizable Desventajas Falsos Positivos (necesita confirmación)

Enzyme Linked Immuno- Sorbent Assay ELISA Enzyme Linked Immuno- Sorbent Assay

Tests Rápidos en un solo paso

5- Radioinmunoensayo (RIA) Fundamento idéntico a ELISA Ventajas Similar al ELISA Desventajas Reactivos Inestables Residuos Radiactivos Relativamente mas Costoso

Métodos Indirectos

Métodos Indirectos Detección de IgM Detección de IgG Seroconversión Infección aguda Infección congénita FR: f+ ↑ IgG: f- IgM Captura Detección de IgG Seroconversión Recién Nacidos Avidez Δ >4 títulos

Técnicas Aglutinación de partículas IFI EIA RIA Western Blott ELISA LIA RIA Western Blott

Western Blot Muy especifica Método confirmatorio

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Western Blot