FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Relevancia Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Conocimiento y búsqueda de información de carácter diagnóstico y pronóstico Conocimiento: lo que ya se sabe: ej leucemia linfatica cronica: CD5 Busqueda: Experimentación básica y prognosis de patologías

¿Qué es la citometría de flujo? Amplificación digitalización Representación y Analisis Meeting point FSC Láser 2- 4º 90º Columna de muestra Detectores de luz Flujo

VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO - Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de células individuales (miles). - Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en la precisión de las medidas. 6

Cámara de flujo Luz incidente FSC 90º Columna de muestra Luz dispersada hacia delante, a=2- 4º Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, a = 90º Cámara de flujo Columna de muestra Sistema de flujo, enfoque hidrodinámico. Lleva células al foco del láser. Ventajas e inconvenientes  No se atasca, pero no mide volumen. Sistema de enfoque hidrodinámico (citómetro) vs principio Coulter (hemocitometro) Cuantificación concentraciones Coulter funciona FACS no.   Fluido envolvente

Información Que Se Obtiene: Luz - Propiedades Al Atravesar La Luz: - Luz Reflejada O Difractada Propiedades Fluorescentes: - Fluorocromos (Fitc, Pe, Apc, Tc…)

Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light ) Detector FSC Detector de 90º SSC Laser

DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) SSC El detector de FSC convierte luz dispersada hacia adelante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula

DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) FSC SSC El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad)

Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular Granulocitos Monocitos Linfocitos

Detector de fluorescencia Detectores de fluorescencia Fluorescencia Detector Detector de fluorescencia (PMT3, PMT4 etc.) Laser

FL-2 Fluorescencia FL-1 FSC

Fluorescencia  2  1 1<2 t (ms) Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón. Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.  2 E  1 1<2 t (ms)

Espectros Espectro de Absorción Espectro de Emisión l (nm) Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia. Espectro de Emisión Representación de la intensidad de emisión de una sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda. l (nm) excitación medida Intensidad de fluorescencia Ventajas de la fluorescencia como sistema de detección La luz emitida se mide a longitudes de ondas mayores no hay background. Pueden detectarse y medirse cantidades muy pequeñas de moléculas 10-20M (unos miles de moléculas) por lo que pueden realizarse medidas en células individuales. Se pueden detectar entre 103 y 107 moléculas.

Fluoresceina (FITC) Proteinas Excitación Emisión 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Proteinas

Proceso de señales 1. Separación de señales luminosas 2. Detección de señales luminosas 3. Amplificación de señales eléctricas 4. Corrección de errores Compensación de señales Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos). 6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante

Optica en los citómetros de flujo PMT 4 Filtros Dicroicos PMT 3 Flujo Celular PMT 2 Bandpass Filtros PMT 1 Laser

PE-TR Conj. Texas Red PI Etidio PE FITC Acido Parinárico Laseres comunes 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 PE-TR Conj. Texas Red PI Etidio PE FITC Acido Parinárico

DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA TC PerCP QR Fluorocromos Cy5 APC Detectores FL-1 FL-2 FL-3 FL-4

Compensación de señales medida FL-1 FL-2 excitación Fundamento Superposición de espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un fluorocromo es leída por el detector de otro color Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color FL-2 - %FL1 Intensidad de fluorescencia l

DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 . 10000 FSC SSC FL-1 FL-2 FL-3 FL-4 TIEMPO Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitales Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico).

Diagramas biparamétricos PROCESO DE INFORMACION Histogramas Diagramas biparamétricos

Proceso de la información generada Representación de la información Selección de la información Reducción de la información De la célula a la población celular

Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad. 12

Histogramas FL-1 SSC FL-2 FSC FL-3 13

Representación biparamétrica en 2D Diagrama de puntos / dot plot Representación simultánea de dos parámetros X e Y para un conjunto de células. X representa el valor de la señal de un parámetro. Y representa el valor de la señal del otro. - + + + FL-2 Cada punto representa la combinación de valores correspondiente a una célula. El diagrama de puntos representa las distintas poblaciones celulares. La frecuencia celular en una región se estima por el número de puntos en esa región, Una Población celular queda representada como una nube de puntos. manera facil de identificar poblaciones raras. - + - - FL-1 17

Diagrama de dot plot density Usa colores para representar densidad 21

Estadisticas biparamétricas - + + + Cuadrantes Combinación de dos umbrales de positividad para dos parámetros Número de células % de células UR UL - - - + LL LR