INCLUSION, PROCESADO, INCLUSION EN PARAFINA Y CORTE ENFOCADO A LA INMUNOHISTOQUIMICA. LCDA REBECA ARRUE, TECNOLOGA MEDICA HISTOTECNOLOGA SERVICIO DE PATOLOGIA

VENCE EL MAL HACIENDO EL BIEN, NO TE CANSES DE HACER EL BIEN A TU PRÓJIMO.

INCLUSION DE LA MUESTRA LA MUESTRA SE RECIBE EN EL LABORATORIO DE PATOLOGIA UNA VEZ QUE ES EXTRAIDA. SE CUENTA CON UN CUARTO DE CORTE QUE ES EL AREA DESIGNADA PARA RECIBIR, REGISTRAR, FOTOGRAFIAR, DISECAR Y TALLAR LA MUESTRA. EN EL LABORATORIO DE PATOLOGIA SE COLOCA LA MUESTRA EN LA FORMALINA BUFFERIZADA 10% PARA SU FIJACION. LA FIJACION DEBE INICIAR ANTES DE LOS 30 MINUTOS.

INCLUSION DE LA MUESTRA YA QUE SI EL TEJIDO PERMANECE MUCHO TIEMPO SIN FORMALINA EMPIEZA LOS PROCESOS DE AUTOLISIS (por acción de las enzimas intracelulares), PUTREFACCION (por acción bacteriana). ES IMPORTANTE UNA VEZ QUE SE RECIBE LA MUESTRA (PIEZA QUIRURGICA), EL PATOLOGO DEBE SECCIONAR LA PIEZA PARA QUE HAYA UNA MEJOR PENETRACION DEL FIJADOR AL TEJIDO.

SELECCION DEL FIJADOR TIPO DE FORMALINA INFLUYE EN LOS ESTUDIOS DE H&E, INMUNOHISTOQUIMICA Y TECNICAS MOLECULARES. SI ES UNA FORMALINA QUE SE PREPARA EN EL LABORATORIO Y NO SE LE AGREGAN LOS FOSFATOS VAMOS A TENER UNA FORMALINA ACIDA. LA FORMALINA ACIDA PRODUCE UN PRECIPITADO COLOR NEGRO/MARRON EN LA TINCION DE H&E. SU EFECTO MAYOR ES SOBRE LAS PROTEINAS, ACIDOS NUCLEICOS(ADN Y RNA), LIPIDOS Y CARBOHIDRATOS.

FIJACION SI LA FORMALINA ESTA MUY CONCENTRADA ESTA VA A DAÑAR EL TEJIDO. EL TEJIDO SE VA A ENDURECER Y SE VA A ENCOGER. SI EL TEJIDO NO TIENE EL VOLUMEN ADECUADO DE FORMALINA ESTE NO SE VA FIJAR. (MAL FIJADO). LA TEMPERATURA OPTIMA DE FIJACION ES A TEMPERATURA AMBIENTE.

FIJACION EL AUMENTO DE LA TEMPERATURA INCREMENTA LA VELOCIDAD DE FIJACION Y EL TEJIDO SE QUEMA. SI EL TEJIDO VIENE CON LA FORMALINA BUFFERIZADA AL 10% Y ES UN TEJIDO RICO EN SANGRE Y SI NO SE TIENE EL CUIDADO DE CAMBIAR LA FORMALINA, ESTA SE OXIDA Y SE PRODUCE ACIDO FORMICO. Y VA A PRODUCIR UN PRECIPITADO QUE ES DERIVADO DE LA HEMATINA Y EL PH DISMINUYE A 6

INCLUSION DE LA MUESTRA (FIJACION) LA MUESTRA SE COLOCA EN UN VOLUMEN DE 10 VECES SU TAMAÑO. FIJACIÓN DEBE ESTAR EN UN RANGO DE 6-24HORAS/24-48 HORAS DEPENDE DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA.

INCLUSION DE LA MUESTRA SOBREFIJACION DE LA MUESTRA LA SOBREFIJACION ENMASCARA EL EPITOPE PORQUE SE VAN A FORMAR MAS PUENTES DE METILENO. DEBIDO A QUE EL FORMALDEHIDO PERTENECE AL GRUPO DE LOS ALDEHIDOS Y ESTE GRUPO SE HIDRATA Y SE FORMAN LOS PUENTES DE METILENO CON LOS AMINOACIDOS DEL TEJIDO. A LA HORA DE LA RECUPERACION ANTIGENICA NO SE LOGRA DESENMASCARAR EL EPITOPE POR LA GRAN CANTIDAD DE PUENTES DE METILENO.

LA SOBREFIJACION PRODUCE UNA TINCION DEBIL (SEÑAL) O NADA DE SEÑAL. ARTEFACTOS LOS PROCESOS DE FIJACIÓN PUEDEN ACARREAR ALTERACIONES TISULARES COMO VARIACIONES MORFOLÓGICAS, CRISTALIZACIÓN DE COMPUESTOS, DESPLAZAMIENTO DE SUSTANCIAS, ETCÉTERA. ESTOS CAMBIOS PUEDEN PRODUCIRSE POR LAS CARACTERÍSTICAS DEL FIJADOR O POR UN MAL USO DE ÉSTE.

SI EL TEJIDO ESTA SOBREFIJADO O POCO FIJADO A LA HORA DE LA INTERPRETACION DEL CASO TE VAS A ENCONTRAR CON BACKGROUND. TIPO DE FIJADOR VA A PRODUCIR UNA REACCION CRUZADA NO PROTEINICA (AMINOACIDOS). VOLUMEN Y CONCENTRACION INADECUADOS DEL FIJADOR PRODUCE UNA TINCION HETEROGENEA. TIEMPO EN EL FIJADOR PRODUCE BACKGROUND, TINCION NO ESPECIFICA, BACKGROUND CON TINCION NO ESPECIFICA.

SI EL FORMALDEHIDO REACCIONA CON LOS AMINOACIDOS DENTRO DEL EPITOPE, EL ANTICUERPO SERA INCAPAZ DE UNIRSE. SI HAY CAMBIOS CONFORMACIONALES QUE RESULTEN DE LA REACCION DEL FORMALDEHIDO CON LOS AMINOACIDOS ADYACENTES AL EPITOPE ESTOS PUEDEN REVERTIRSE A MENUDO CON LA DIGESTION ENZIMATICA O LA RECUPERACION ANTIGENICA POR CALOR.

ANTES DE COLOCAR UN TEJIDO EN DECAL ESTE DEBE ESTAR FIJADO 24 HORAS. LUEGO SE COLOCA EN LA SOLUCION DECALCIFICANTE. ESTA SOLUCION PRODUCE DEGRADACION DEL EPITOPE.

CUARTO DE CORTE DESCRIPCION MACROSCOPICA DE LA BIOPSIA O PIEZA QUIRURGICA. MUESTREO TISULAR SI EL PATOLOGO SELECCIONA EL AREA INCORRECTA OBVIAMENTE A LA HORA DE LA LECTURA NO VA ENCONTRAR NADA. MANEJO ADECUADO DE LAS MUESTRAS. SI LAS MUESTRAS NO SE FIJAN ANTES DE ENTRAR AL PROCESADOR SE CORRE EL RIESGO DE QUE QUEDEN MAL FIJADAS.

INCLUSION DE LA MUESTRA (FIJACION) LAS SECCIONES DE TEJIDO SELECCIONADAS NO DEBEN SUPERAR LOS 3MM DE ESPESOR DEBIDO A QUE SE NECESITA QUE ESA SECCION SE FIJE. GROSOR DEL TEJIDO A INCLUIR: 2-3MM SABEMOS QUE LA FIJACION SE HACE A TEMPERATURA AMBIENTE Y QUE LA VELOCIDAD DE PENETRACION ES DE 1MM/HORA.

INCLUSION DE LA MUESTRA (FIJACION) SI EL ESPESOR O GROSOR DEL TEJIDO ES MAYOR DE 3MM ESTO AFECTA LA FIJACION DEL TEJIDO PORQUE LA VELOCIDAD DE PENETRACION DEL TEJIDO ES DE 1MM/HORA SI EL TEJIDO NO SE FIJA EN EL CENTRO A LA HORA DE HACER EL CORTE NO VA HABER TEJIDO EN ESA AREA. EL LARGO DEL TEJIDO NO DEBE SOBREPASAR LOS MARGENES DE INCLUSION.

INCLUSION DE LA MUESTRA (FIJACION) LAS SECCIONES DE MUESTRAS SELECCIONADAS SE COLOCAN EN SUS RESPECTIVOS CASSETTES DE INCLUSION. SE CUENTA CON BAÑOS DE FORMALINA BUFFERIZADA 10 % Y UN BAÑO DE FORMALINA ALCOHOLICA. LA FORMALINA ALCOHOLICA (FORMALINA+ETANOL) ES PARA PRESERVAR MEJOR LOS CARBOHIDRATOS, CAUSA MENOS ACHICAMIENTO CELULAR Y MENOS ENDURECIMIENTO. SI EL TEJIDO ESTA MAL FIJADO NO VA HABER UNA BUENA RECUPERACIÓN ANTIGENICA.

PROCESADO DEL TEJIDO ES IMPORTANTE EL PROCESAMIENTO DEL TEJIDO. PASO 1. FIJACIÓN PASO 2. DEHIDRATACIÓN DEPENDE DE LA CALIDAD DEL ETANOL. LA CONCENTRACION DEL ETANOL. PASO 3. ACLARAMIENTO DEPENDE DE LA CALIDAD DEL SOLVENTE. PASO 4. INFILTRACION DEPENDE DE LA CALIDAD DE LA PARAFINA.

PROCESADO DEL TEJIDO PASO 2. DESHIDRATACION YA SEA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ALCOHOL ESTEN MUY CONCENTRADAS O CON UNA CONCENTRACION MENOR, NO SE VA A REMOVER TODA EL AGUA QUE SE ENCUENTRA EN LOS ESPACIOS INTRACELULARES Y EXTRACELULARES DEL TEJIDO.

PROCESADO DEL TEJIDO AL NO REMOVER TODA EL AGUA DEL TEJIDO, POSTERIORMENTE LA INFILTRACION POR PARAFINA NO SE VA HACER ADECUADAMENTE YA QUE EL AGUA NO ES MISCIBLE CON LA PARAFINA. ES IMPORTANTE MENCIO- NAR QUE EL TEJIDO SE TERMINA DE FIJARSE EN LOS ALCOHOLES.

PROCESADO DEL TEJIDO LA DESHIDRATACION PROLONGADA CAUSA: RESEQUEDAD ENDURECIMIENTO DEL TEJIDO CAMBIA LA CONFIGURACION DE LAS PROTEINAS EN EL TEJIDO.

PROCESADO DEL TEJIDO PASO 3. ACLARAMIENTO SE USA XILOL EL CUAL ES UN SOLVENTE. HIDROCARBURO. ANILLO BENCENICO COMPUESTO POR UNA MEZCLA DE ISOMEROS META, PARA Y ORTO. EN ESTE PASO EL AGENTE ACLARANTE ELIMINA EL ALCOHOL DEL TEJIDO.

PROCESADO DEL TEJIDO SI EL TEJIDO SE DEJA MUCHO TIEMPO EN EL XILOL ESTE SOLVENTE HACE QUE EL TEJIDO SE VUELVA QUEBRADIZO AL ENDURECERSE ESTE SE VUELVE QUEBRADIZO. EL TEJIDO SE RESECA. DEGENERA LAS MOLECULAS DEL TEJIDO.

PROCESADO DEL TEJIDO PASO 4. INFITRACION POR PARAFINA LA PARAFINA ES UNA SUSTANCIA CONFORMADA POR HIDROCARBUROS SATURADOS DE CADENAS LARGAS. EL PUNTO DE FUSIÓN PERMITE LA CATEGORIZACIÓN DE LAS MISMA. TIPOS DE PARAFINA: BLANDAS DURAS

PROCESADO DE TEJIDO LA INFILTRACION DEPENDE DE LA CALIDAD DE LA PARAFINA Y SU PUNTO DE FUSION. YA QUE SI UTILIZAMOS UNA PARAFINA CON UN PUNTO DE FUSION MAYOR DE 60°C ESTO VA A PRODUCIR QUE LOS EPITOPES SE PIERDAN EN LOS BAÑOS DE PARAFINA. YA QUE SE VA A REQUERIR DE UNA TEMPERATURA ALTA PARA QUE ESTA SE DERRITA. LAS TEMPERATURAS ALTAS DEGENERAN LA PUREZA DE LAS MOLECULAS DE PARAFINA POR MUY BUENA QUE SEA LA PARAFINA.(58- 60°C)

PROCESADO DEL TEJIDO LA TEMPERATURA ALTA EN LOS BAÑOS DE PARAFINA DEL PROCESADOR DE TEJIDOS DESTRUYE EL EPITOPE DEL TEJIDO.

AL HABER UN MAL PROCESAMIENTO EL EPITOPE O LOS EPITOPES SE DEGRADAN POR CONSIGUIENTE VA A HABER UNA MALA RECUPERACION ANTIGENICA.

EMBEBIDO EN PARAFINA (BLOQUEO) TIPO DE PARAFINA PUNTO DE FUSION CORTE BLANDA50-52°CGRUESO BLANDA53-55°CGRUESO DURA*56-58°CFINO DURA60-68°CFINO

EMBEBIDO EN PARAFINA (BLOQUEO) CENTRO DE BLOQUEO SI LA PLANCHA CALIENTE DEL CENTRO DE BLOQUEO TIENE UNA TEMPERATURA MAYOR DE 60°C. EL CALOR DESTRUYE EL EPITOPE. AL QUEMAR LOS TEJIDOS CAMBIA LA CONFIGURACION DE LAS PROTEINAS.

CORTE HISTOLOGICO PARA INMUNOHISTOQUIMI CA SE REQUIERE QUE SE HAGAN CORTES DE 4 MICRAS. PARA TECNICAS MOLECULARES (FISH, CISH) CORTES DE 4 MICRAS. LA PARAFINA QUE SE USE EN LA CONFECCION DEL BLOQUE DEBE SER IDEAL PARA QUE A LA HORA DE HACER EL CORTE ESTA SE EXPANDA BIEN EN EL BAÑO FLOTADOR.

CORTE HISTOLOGICO LA TEMPERATURA DEL BAÑO DEBE OSCILAR ENTRE °C PARA QUE EL TEJIDO SE EXPANDA BIEN. PARA QUE NO HAYA ARRUGAS SOBRE EL TEJIDO. LAS ARRUGAS EN EL TEJIDO ENMASCARA EL EPITOPE. SI EL TEJIDO DE ESTUDIO SE COLOCA ENCIMA DE LA PARAFINA DEL CONTROL ESA PARTE SE VA A CAER EN EL PASO DE DESPARAFINAR.

CORTE HISTOLOGICO AL AGUA DEL BAÑO NO SE LE DEBE COLOCAR NINGUN ADITIVO. YA QUE ESTO PUEDE PRODUCIR UNA REACCION INESPECIFICA. BURBUJAS EN EL BAÑO. A LA HORA DE PESCAR EL TEJIDO EN EL BAÑO NO DEBE HABER BURBUJAS LAS BURBUJAS SOBRE EL TEJIDO ENMASCARA AL EPITOPE.

CORTE HISTOLOGICO LAS LAMINAS DEBEN TENER CARGAS + PARA QUE EL TEJIDO SE ADHIERA Y NO SE CAIGA. NO USAR LAMINAS PREPARADA EN EL LABORATORIO. PORQUE EL TEJIDO SE CAE. LAS CAJAS DE LAS LAMINAS DEBEN PERMANECER CERRADAS UNA VEZ QUE SE USAN. YA QUE LA HUMEDAD HACE QUE SE PIERDA LAS CARGAS + DE LA LAMINA.

EL CORTE TIENE UN VENCIMIENTO. SI EL CORTE DEL CONTROL YA ESTA PRECORTADO. SI EL CONTROL POSITIVO NO MARCA PUEDE DEBERSE A QUE ESTADO MUCHO TIEMPO YA PRECORTADO. CORTES A 4 MICRAS PARA QUE EL TEJIDO NO SE CAIGA, Y QUE SE PUEDA OBSERVAR MEJOR LA SEÑAL. RECOMENDACION DEL COLEGIO AMERICANO DE PATÓLOGOS ES QUE NO ESTÉN MÁS DE 6 SEMANAS ALMACENADOS.

PASO DE DESPARAFINAR EN EL HORNO EL HORNO DEBE TENER UNA TEMPERATURA DE 55°-56°C SE PUEDE DEJAR OVERNIGHT O UNA HORA. UNA TEMPERATURA MAYOR PRODUCE QUE EL EPITOPE SE DESTRUYA POR CONSIGUIENTE SE PIERDE.

GRACIAS