TERAPIA GENICA PARA PREVENIR INTOXICACION POR ORGANOFOSFORADOS Germán A. Vásquez N. Lina P. Roldán F. Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Veterinaria Departamento de Toxicología

INTRODUCCIÓN La terapia génica consiste en insertar copias de genes normales, en individuos con enfermedades genéticas o deficiencias de algunas sustancias (factores de coagulación, enzimas, proteínas) propias del organismo. El objetivo es estimular genéticamente la síntesis de una sustancia de deficiente, defectuosa o ausente.1 La hidrólisis de insecticidas organofosforados gases nerviosos (soman y sarin), esta dada por la enzima sérica, Paraoxonasa (arildialquilfosfatasa).2 L. Orde, J. Carey y P. White. 1996. Genética Médica. Ed. Mosby. Barcelona (España) Pág. 226-229. Cowan J. et. Al (2001). Gene Therapy to prevent Organophosphate Intoxication. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1732, 1-6.

1. TERAPIA GÉNICA Las células blanco de la terapia deben ser fácilmente accesibles y tener una vida media prolongada (fibroblastos, miocítos y hepatocítos). Un método para introducir genes en las células es utilizando vectores retrovirales o adenovirales modificados. Los vectores adenovirales pueden invadir células en división y aceptan máximo inserciones de ocho kb de longitud.

......Terapia génica Los virus se modifican mediante DNA recombinante para disminuir su grado de replicación. El DNA recombinante provoca la mayor deleción del genoma viral, sustituyéndola por una copia normal de un gen humano, sus elementos reguladores y una señal de poliadenilación. Los adenovirus son reproducidos y obtenidos in vitro y se inoculan en el paciente o en células somáticas que se puedan re-inocular.

Modelo terapia génica Síntesis de DNAc de doble Modelo terapia génica Síntesis de DNAc de doble cadena a partir de un RNAm

.....Terapia génica Los adenovirus a diferencia de los retrovirus no se integran en el DNA de la célula huésped, conllevando a su pérdida y originando una expresión transitoria del gen, creando la necesidad de reintroducir el vector.1 L. Orde, J. Carey y P. White. 1996. Genética Médica. Ed. Mosby. Barcelona (España) Pág. 226-229.

2. PARAOXONASA – PON1 (ARILDIALQUILFOSFATASA) Definición: La PON1 es una esterasa calcio dependiente sintetizada en el hígado y que se encuentra en el plasma. El gen PON 1, fue descubierto en 1996. Funciones: Hidroliza metabolitos activos de algunos organofosforados (paraóxon, diazoxón, clorpirofos), gases nerviosos (sarin, soman) y esteres aril (fenilacetato).

.....PON 1 (Funciones) La actividad hidrolítica de la PON1 provee una barrra natural sobre la entrada de tóxicos organofosfatados al sistema nervioso central y periférico. Antioxidante de lipoproteinas de baja densidad, disminuyendo productos de peroxidación lipídica en procesos de inflamación.2 2. Cowan J. et. Al (2001). Gene Therapy to prevent Organophosphate Intoxication. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1732, 1-6.

...... PON 1 ACCIÓN: Actividad catalítica Aril dialkil fosfato + H2O = Dialkil fosfato + Aril alcohol. Rompe unión dialkil aril del organofosforado.4 4. Mackness B. (1997). Effect of the molecular polymorphisms of human Paraoxonase (PON1) on the rate of hydrolysis of Paraoxon. Brittish Journal of Pharmacology. 122, 265-268.

.......PON 1 Características: PON 1 actúa en metabolismo fase II. PON 1h es polimórfica y esta localizada en el cromosoma 7. La relación dosis respuesta de la toxicidad de organofosforado es relativa a la capacidad hidrolítica concentraciones plasmáticas de PON1 entre individuos.3 3. Shih D.M. et. Al (1998). Mice lackyng serum Paraoxonase are susceptible to organophosphate toxicity and atherosclerosis. Nature 394, 284-287.

Actividad enzimática de algunas isoenzimas de PON1 sobre organofosforados OPs Isoen. paraoxón Diazoxón Sarin Soman Clorp. fenilA. Q 192-glu baja media Alta * R 192 – arg alta L 55 – leu + M 55 – met MM

3. MÉTODO EXPERIMENTAL Se considero la protección como un rol crítico debido a : La alta susceptibilidad de los animales con niveles bajos de PON1 ha envenenamiento con insecticidas. 2. La habilidad de purificar la enzima PON1 para proteger a los roedores contra el desafío de paraoxon y clorpirifos y sus posibles aplicaciones en humanos.  

..... Método experimental Relación experimental: Se aisló DNAc PON1 a partir de líneas celulares hepáticas humanas. Se produjo adenovirus recombinantes con plásmidos respectivos para cada gen que codifica las isoenzimas.

..... Método experimental Se inocularon IV los adenovirus recombinantes a ratones. El día 4 se aplico clorpirifos. 18 a 24 horas después se sacrificaron los ratones y se obtuvo los cerebros. Se midió indirectamente arilesterasa sérica, acetil colinesterasa cerebral y paraoxonasa de acuerdo a sus productos con espectrofotometría de doble haz.

.... Método experimental Resultados: Se demostró que la actividad de la arilesterasa se incrementó un 50% en los ratones inyectados con adenovirus sobre los ratones control. Se determino la dosis estándar de clorpirifos ha administrar para producir una respuesta tóxica (30mg/Kg) de acuerdo a los niveles de colinesterasa expresados en el cerebro.

Niveles de arilesterasa y actividad de la paraoxonasa en el suero obtenidos tres días después de la administración de adenovirus a ratones.

...Método experimental Resultados: La actividad sérica de la Paraoxonasa en el grupo PON 1 R, fue mayor que el grupo PON1 Q y el control. La acetilcolinesterasa se mantuvo estable en los dos grupos prueba, más que en el grupo control (post administración de clorpirifos) 5 de los 15 ratones tratados con adenovirus recombinante PON1R recibieron una protección completa contra clorpirifos.2 2. Cowan J. et. Al (2001). Gene Therapy to prevent Organophosphate Intoxication. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1732, 1-6

Actividad de la acetilcolinesterasa en cerebro de ratón

CONCLUSIONES La producción recombinante de paraoxonasa/arilesterasa humana a partir de la reposición de un gen por un vector puede incrementar los niveles séricos de paraoxonasa y arilesterasa, ya que la enzima recombinante producida puede reducir o prevenir la entrada de clorpirifos al cerebro.

.... Conclusiones Las dos isoformas son igualmente activas sobre el fenil-acetato (sustrato de la arilesterasa). Sólo la PON1R incrementó la actividad sérica de la paraoxonasa. Tanto la PON1Q y PON1R proveen protección sobre la inhibición de acetilcolinesterasa en todo el cerebro producido por el clorpirifos donde la PON1R refleja un 30% más de actividad que la PON1Q.

DISCUSIÓN Expresión transitoria y de bajo nivel del producto génico Dificultades para alcanzar el órgano blanco Potencial de oncogenicidad Regulación precisa de la actividad del gen Se debe apreciar el uso potencial de vectores como el adenovirus que permiten la expresión génica no tóxica y de largo plazo para ciertas sustancias que disminuyan la variabilidad individual

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