CULTIVO DE VIRUS EN LABORATORIO H. Rivera.

EL VIRUS Los virus son microorganismos estrictamente intracelulares. Ha perdido la información genética para codificar la maquinaria necesaria para la generación de energía metabólica o síntesis de proteínas Por tanto, dependen absolutamente de células vivas para replicarse Afectan: bacterias, invertebrados, vertebrados y plantas

SISTEMAS PARA EL CULTIVO DE VIRUS Cultivos celulares: monocapas celulares Primarios Líneas celulares Líneas celulares contínuas o estables Huevos embrionados aviares: Diferentes edades y vías de inoculación Animales de laboratorio: Ratones, hamsters, monos, etc. Animales hospedadores naturales: Primates no humanos, bovinos, porcinos, ovinos, etc.

CULTIVOS CELULARES Importancia: Investigación científica Aislamiento e identificación de virus Diagnóstico de enfermedades virales. Preparación de reactivos: Anticuerpos monoclonales Preparación de vacunas de uso veterinario y humano Determinación de toxinas bacterianas

CULTIVO CELULAR PRIMARIO Células preparadas a partir de tejidos u órganos fetales Disgregación mecánica o enzimática Selección: células que sobreviven disgregación, adhieren a matriz y capaces de dividirse y formar monocapa Método de explante: Apropiado para tejidos blandos o pequeños

LÍNEAS CELULARES Líneas celulares o cultivos secundarios: despúes del primer subcultivo o “pasaje” Puede ser subcultivada hasta 10 a 12 veces Luego mueren (apoptosis)

LÍNEA CELULAR CONTÍNUA O ESTABLE Son de origen tumoral (Ejem: transfección con oncogenes Son originados por virus tumorales Por tratamiento con sustancias carcinogénicas Algunas líneas celulares: VERO: Riñon de mono verde africano ST: células de testículos de cerdo RK 13: células de riñón de conejo PK-15: células de riñón de cerdo

Células vero: muestra del AATCC (American Type Culture Collection)

DIFERENCIAS ENTRE CULTIVO DE CELULAS SECUNDARIAS Y LINEAS ESTABLES Cultivos celulares secundarios: Cariotipo diploide Son mortales Tienen fenómeno de inhibición por contacto Requieren superficie para iniciar división celular Requieren de factores de crecimiento: suero fetal Líneas celulares continuas o estables: Cariotipo poliploide Son inmortales No tienen fenómeno de inhibición por contacto No requieren superficie para iniciar división celular No requieren suero fetal o en concentraciones bajas

MATERIALES DE PLÁSTICO, MEDIOS

FLUJO LAMINAR, MICROSCOPIO INVERTIDO

Materiales y equipos utilizados para la elaboración de cultivos celulares

CAMBIOS OBSERVADOS EN LAS MONOCAPAS Monocapa normal Monocapas infectadas: Lisis Corpúsculos de inclusión Presencia de antígeno

CULTIVO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Uso de huevos embrionados: Permite cultivo viral en forma sencilla, barata y no requiere de equipos sofisticados. Susceptibilidad de sus tejidos a numerosos virus aviares Se debe emplear huevos libres de agentes patógenos: SPF La inoculación se realiza por diversas rutas que esta en función a la edad del embrión

VÍAS DE INOCULACIÓN DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Saco vitelino: embriones de 5-6 días Cavidad alantoidea: embriones 8-9 días Membrana corioalantoidea: embriones 10-11 días Saco amniotico: embriones 11-12 días Endovenosa: embriones 12-14 días

Vías de inoculacion más comunes

Observación de lesiones en huevos embrionados inoculados con el virus de la viruela aviar, Herpes

CULTIVO DE VIRUS EN ANIMALES DE LABORATORIO Para cultivar virus en animales de laboratorio debe tenerse en cuenta: Tropismo: Rutas de inoculación: Respuesta del animal a la inoculación: Confirmación con pruebas adicionales: Presencia de cuerpos de inclusión Presencia de antígeno viral