Principios de Identificación

Los cultivos de bacterias provenientes de infecciones en diversos sitios corporales se llevan a cabo mediante la siembra de muestras procesadas directamente en los medios artificiales. Para favorecer el crecimiento, el aislamiento y la selección de los agentes etiológicos las muestras se siembra generalmente por estrías de agotamiento.

Evaluación de la morfología de la colonia. Tinción de Gram y subcultivos. La tinción de gram y la evaluación microscópica de los cultivos de las bacterias, junto con la morfología de la colonia, sirven para decidir los pasos de identificación necesarios. Para evitar confusiones se tiñen los microorganismos provenientes de cada colonia.

Existen casos en donde la tinción no es necesaria por que el crecimiento en un agar selectivo proporciona datos relacionados con la morfología en la tinción de gram. Ej: Bacilos gram negativos son las únicas bacterias de relevancia clínica que crecen bien en agar de MacConkey

Después de la descripción de las características del crecimiento en los medios en placa primarios todos los procedimientos posteriores para la identificación definitiva requieren el uso de cultivos puros. Se toma una porción de una colonia aislada se la transfiere a la superficie de un medio de enriquecimiento adecuado que luego se incuba en condiciones óptimas para el microorganismos.

Una vez que se dispone de cultivos puros en cantidad suficiente puede prepararse un inóculo para los procedimientos de identificación posteriores. Las pruebas y el orden en el que se las utiliza para la identificación del microorganismo a menudo se denominan esquemas de identificación

Los esquemas de identificación pueden clasificarse en dos categorías: -los que se basan en características genotípicas de las bacterias -los basados en las características fenotípicas Características fenotípicas Los criterios fenotípicos utilizados con mayor frecuencia son: 1-Morfología microscópica y características tintoriales.

2-Morfología macroscópica ( colonias) 3-Requerimientos ambientales para el crecimiento 4-Resistencia o sensibilidad a los antimicrobianos 5-Requerimientos nutricionales y propiedades metabólicas

1-Morfología microscópica y características tintoriales 1-Morfología microscópica y características tintoriales. La tinción de gram del crecimiento bacteriano a partir de colonias aisladas en diversos medios suele ser el primer paso en todo esquema de identificación. En donde pueden dividirse en cuatro grupos: -cocos gram positivos -cocos gram negativos -bacilos gram positivos -bacilos gram negativos

2-Morfología macroscópica ( colonias) En la evaluación de la morfología de la colonia se considera el tamaño, forma, color, todo cambio que el desarrollo de la colonia produce en el medio agar que la rodea Ej: hemólisis en agar sangre. Si bien estas características no son suficientes para establecer una identificación final o definitiva, la información obtenida proporciona datos preliminares necesarios para determinar que procedimiento de identificación seguir.

3-Requerimientos ambientales para el crecimiento Las condiciones ambientales requeridas para el crecimiento puede utilizarse como complemento de otros criterios de identificación. Sin embargo, como sucede con la morfología de las colonias, esta información sola no es suficiente para establecer una identificación definitiva.

4-Resistencia o sensibilidad a los antimicrobianos La comprobación directa de la sensibilidad de una bacteria aislada a determinado antimicrobiano pude ser muy útil como parte de un esquema de identificación. Muchas bacterias gram positivas son sensibles a vancomicina, un antimicrobiano que actúa sobre la pared celular bacteriana. Por el contrario las gram negativas son resistentes a este antibiótico.

5-Requerimientos nutricionales y propiedades metabólicas Las propiedades nutricionales y metabólicas de un aislamiento bacteriano son los parámetros más utilizados para establecer el género y la especie de un microorganismo. En general, utilizan una combinación de pruebas para establecer las propiedades enzimáticas de un aislamiento bacteriano dado, así como la capacidad de crecer o sobrevivir en presencia de ciertos inhibidores.

Prueba para enzimas individuales Es una prueba fácil y rápida en líneas generales juega un papel fundamental en el esquema de identificación. -Prueba de la catalasa -Pueba de la oxidasa -Prueba del indol -Prueba de la ureasa -Hidrólisis del hipurato

1-Prueba de la catalasa: Fundamento La presencia de la enzima en un aislamiento bacteriano se pone en evidencia cuando se introduce un inóculo dentro del peróxido de hidrógeno y se produce la formación rápida de burbujas de oxígeno.

Método -Se toma con un ansa una pequeña cantidad del crecimiento de una colonia en la superficie de un portaobjetos. -Se coloca una gota de peróxido de hidrógeno al 30%. -Se observa la presencia de burbujas.

Resultados Positivo: producción de burbujas Negativo: ausencia de burbujas

2-Prueba de la oxidasa: Fundamento Es una prueba que se utiliza para determinar la presencia de citocromooxidasa bacteriana mediante el empleo de la oxidación del sustrato dihidroclorhidrato de tetrametil p-fenilendiamina a indofenol que es un producto de color violeta.

Método -Se humedece un papel de filtro con el sustrato, posteriormente se coloca la muestra con un ansa y se observa la formación de un color violeta. Resultados Positivo: desarrollo del color violeta dentro de los 10 segundos. Negativo: ausencia de color.

3-Prueba de Indol: Fundamento La prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de degradar el triptófano para formar el compuesto indol.

Método: -Se siembra el caldo con triptófano con 1 gota de un cultivode 24 hs en caldo. Se incuba a 35°C durante 48 horas -Se agrega 1 ml de xileno al cultivo -Se agita para extraer el indol y se deja reposar para que el xileno forme una capa en la parte superior de la fase acuosa. -Finalmente se agrega el reactivo de Ehrlich Resultados Positivo: anillo de color rosado a rojo oscuro Negativo: sin cambio de color

4-Prueba de la ureasa: Fundamento La prueba determina la capacidad de un Microorganismo de producir la enzima ureasa, que hidroliza la urea. En la hidrólisis se produce amoniaco y CO2 .La formación de amoniaco alcaliniza el medio y provoca el cambio de pH que se detecta por el cambio de color.

Método -Se siembra por estría en la superficie del agar inclinado para urea una porción de una colonia bien aislada. -Se incuba a 35°C durante 48 horas Resultados Positivo: cambio de color del agar del naranja pálido a fucsia. Negativo: sin cambio de color queda naranja pálido

5-Hidrólisis del hipurato 5-Hidrólisis del hipurato. Fundamento Los productos finales del ácido hipúrico por la hipuricasa son la glicina y el ácido benzoico. La glicina es desaminada por el agente oxidante ninhidrina, que se reduce durante el proceso. Los productos terminales de la oxidación de la ninhidrina reaccionan para formar un producto de color violeta más intenso.

Método -Se agrega 0. 1 ml de agua estéril a un tubo Método -Se agrega 0.1 ml de agua estéril a un tubo. Se hace una suspensión espesa del microorganismo a evaluar -Se coloca en la mezcla un disco de hidrólisis rápida del hipurato. -Se incuba por 2 hs a 35°C -Se agrega 0.2 ml de ninhidrina y finalmente se incuba 15 minutos. Resultado Positivo: color violeta intenso Negativo: incoloro

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