Determinación in-vitro de cepas de Botrytis cinerea resistentes a benzimidazoles. Muñoz C., Oriolani E., Gomez Talquenca S. Laboratorio de Fitovirología - EEA Mendoza INTA. San Martín 3853 Lujan de Cuyo (5507), Mendoza, Republica Argentina. Teléfono (0261) / INTRODUCCION Botrytis cinera es un fitopatógeno que causa la enfermedad de la podredumbre gris en una gran variedad de plantas. La resistencia a benzamidazoles esta relacionada con mutaciones puntuales en el gen codificante para la  -tubulina, que conducen a la substitución de aminoácidos en las posiciones 198 y 200, esta substitucion conduce a una alteración en el sitio de unión a los compuestos benzamidazolicos generando resistencia a este botrycida. OBJETIVOS 1. Determinar si existe resistencia a Benzamidazoles (Carbendazim) en una población reducida de cepas de B. cinerea aislados de vid. 2. Determinar las mutaciones puntuales responsable esta resistencia (aa ). 3. Determinar las concentraciones mínimas de botrycidas inhibitorias del 50 % del crecimiento miceliar, en aislamientos sensibles y resistentes. MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento fúngicos: Se trabajo sobre 10 cultivos monosporicos de B. cinerea aislados de vid sin datos previos sobre su suceptibilidad a fungicidas. PCR del gen  -tubulina: Se diseñaron primers (TUB-F,TUB-R) para la región flanqueante a las mutaciones Glu 198 y Phe 200 del gen  -tub que amplifican un fragmento de 372 bp. El producto de PCR fue secuenciado directamente. Co-PCR: se diseñaron dos primers internos (TUB-WT, TUB-M) los cuales se encuentran en direcciones opuestas para determinar en una sola reacción si una cepa presenta la mutación AxC que conduce a la substitucion GluXAla. Determinacion de la dosis mediana efectiva (EC 50 ): Se trabajo con concentraciones de carbendazim a 0, 1, 2.5, 5, 10 y 20 mg/l en medio APG por triplicado. RESULTADOS Las 10 muestras amplificaron un fragmento del tamaño esperado para el gen de  -Tubulina (372 pb). Las muestras se secuenciaron directamente dando como resultado que 3 de las 10 muestras mostraron un genotipo mutante con subtituciones en la posicion Glu 198 X Ala. En Phe 200 no se encontraron mutaciones. La determinación del EC 50 mostró valores de resistencia de  g/ml para los genotipos mutantes y < 1  g/ml para el genotipo wild type. Estos datos son coincidentes con los esperados por co-PCR CONCLUSIONES Estos datos confirman la presencia de cepas de B. cinerea resistentes a botrycidas benzamidazolicos aislados de vid. Los genotipos resistentes mostraron la mutación Glu 198 X Ala y no se obserbo la mutación Phe 200. La reacción co-PCR resulto ser confiable y predijo precisamente la resistencia o la sensibilidad al botrycida. Genotipo ResistenteGenotipo Sensible.. GCG ACC TTC.... CTC TGG AAG.. AlA Thr Phe.. GAG ACC TTC.... CTC TGG AAG.. GlU Thr Phe T G TUB-F TUB-R B- TUBULINA 372 pb CO-PCR Resistente 50 bp Sensible 370 bp 250 bp 150 bp ALELO MUTANTE 252 pb ALELO WILD TYPE 154 pb FINANCIACION: Este trabajo fue financiado con fondos del proyecto INTA PNFRU NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN C NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN A NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN B- TUBULINA 372 pb ALELO MUTANTE 252 pb ALELO WILD TYPE 154 pb TUB-WT TUB-M