Nuestro grupo de investigación se interesa desde hace años por la reducción del grado alcohólico de los vinos mediante la respiración de una fracción del azúcar del mosto por parte de las levaduras en lugar de su fermentación. Una de las principales limitaciones de esta estrategia es el efecto Crabtree, que hace que, a las concentraciones de azúcar presentes en el mosto, Saccharomyces cerevisiae recurra fundamentalmente al metabolismo fermentativo para la obtención de energía a partir de las hexosas. La otra limitación es la gran producción de acidez volátil (ácido acético), por parte de varias especies de levaduras, y específicamente S. cerevisiae, en las condiciones de oxigenación necesarias para que respiren. En otros proyectos estamos desarrollando el uso de levaduras de otras especies, que tienen la ventaja de no tener un efecto Crabtree tan acusado y además no incrementar de manera tan significativa la producción de ácido acético en condiciones de oxigenación. Sin embargo, los mecanismos responsables de la alta producción de ácido acético en condiciones de oxigenación por parte de S. cerevisiae han sido poco estudiados hasta ahora. Por este motivo estamos investigando el efecto de la deleción de varios genes clave, tanto sobre el balance respiro-fermentativo, como sobre la producción de ácido acético en esta especie; con el fin de aportar nuevos datos para comprender el mecanismo responsable del incremento de la acidez volátil con la oxigenación. INTRODUCCIÓN Las condiciones microaerófilas utilizadas en este estudio fueron suficientes para inducir la respiración de una parte de los azúcares en todas las cepas ensayadas. Esta actividad respiratoria logró una reducción en la producción de etanol del 25% en estas condiciones con respecto a las fermentativas. El impacto de los mutantes delecionados sobre el rendimiento en etanol en mosto natural es muy bajo. Estas condiciones de aireación inducen una producción excesiva de ácido acético. La deleción de REG1 dio lugar a una considerable reducción en la acidez volátil, en comparación con la cepa original fermentando en las mismas condiciones. Como consecuencia de la reducción en la producción de acético, el metabolismo de S. cerevisiae incrementó su producción de glicerol. 1.- Hughes T. R. et al Nature Genetics 25; 3: Pierce, S. E., et al Nature protocols 2(11): Brochado A. R. et al Microbial Cell Factories 9: Herwig C. et al Enzyme and Microbial Technology31(4): De acuerdo con la literatura, existen genes cuya deleción resulta positiva en procesos de respiración (Herwig C. et al. 2002; Enzyme and Microbial Technology 31(4): ). Por ello se llevó a cabo la deleción de los genes HXK2, REG1 y PYK1 en una cepa vínica industrial homozigota como es S. cerevisiae FX10, además de los genes involucrados observados en este estudio PDE2 y PDC1. Posteriormente las cepas recombinantes se inocularon en biorreactores conteniendo en mosto natural (190 g/L azúcar), en condiciones clásicas de fermentación y microaeróbicas (2.5 L/h aire). Zoel Salvadó, Alda Rodrigues, Jordi Tronchoni, Ramón González, José Antonio Curiel, Pilar Morales Instituto de las Ciencias de la Vid y el Vino CSIC-UR-GR En este estudio se ajustó un modelo predictivo metabólico, diseñado para mejorar la producción de vainillina en S. cerevisiae (Brochado A. R. et al. 2010; Microbial Cell Factories, 9:84), para reducir la producción de etanol. El análisis predictivo determinó que la deleción del gen PDC1 podría reducir el 30% de la actividad piruvato descarboxilasa y por lo tanto aliviar el efecto Crabtree en condiciones de aireación. Seis de 25 cepas derivadas de S. cerevisiae BY4743 se seleccionaron por su respuesta positiva en aireación y cuyas deleciones están directamente relacionadas con el metabolismo respiratorio. Posteriormente se inocularon en mosto natural bajo condiciones microaeróbicas de fermentación (1 vol/h aire) No se observó ningún cambio significativo en la producción de etanol, sin embargo el descenso de la concentración de ácido acético en el delecionante ΔΔPDE2, lo hace un buen candidato para la reducción de acético en vinos desarrollados en condiciones de microoxigenación controlada. Selección de genes involucrados en respiración Construcción de cepas vínicas recombinantes MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS CONCLUSIONES Por otro lado la concentración de ácido acético encontrada en esas condiciones respiratorias fue superior en todas las cepas recombinante con respecto al control, salvo en el delecionante ΔΔREG1, el cual presentó una producción de ácido acético de 1,07 Y ACE/S. Yes (g EtOH/g Gluc + Fruc) mg acético/L Se observó que ninguna cepa recombinante logró reducir la producción de etanol con respecto a la cepa control en condiciones microaeróbicas, sin embargo el empleo de dichas condiciones redujeron en un 25% comparado con el etanol producido bajo una fermentación típica. Anaerobiosis Microaerobiosis Debido a este comportamiento y teniendo en cuenta en metabolismo de azúcares, se cuantificó la concentración de glicerol producido de todos los delecionantes. Se comprobó que la cepa recombinante ΔΔREG1 incrementó la concentración de glicerol como respuesta a la reducida producción de acético. Y ACE/S microaerobiosis Y ACE/S anaerobiosis Gramos glicerol/L Yes (g EtOH/g Gluc + Fruc)