CROMATOGRAFÍA Mikhail Semenovich Tsweet, 1872-1919 Botánico Ruso que en 1906 desarrolló un método para separar los distintos tipos de clorofila de extractos vegetales

¿Qué es la cromatografía? Un método que permite separar los diferentes componentes de una mezcla compleja Esta separación se logra por la diferencia en la movilidad relativa de los solutos, lo cual se logra por las distintas interacciones físicas y químicas entre los componentes de la cromatografía

Componentes de una Cromatografía FASE ESTACIONARIA FASE MÓVIL MUESTRA O ANALITO

Clasificacion de las CROMATOGRAFÍAS Según el SOPORTE Según el EQUILIBRIO DE SEPARACIÓN Según el ESTADO DE AGREGACIÓN DE LA FASE MÓVIL

Clasificación según SOPORTE PLANAS = TLC (Thin Layer Chromatography) Silicagel Papel Acetato de Celulosa COLUMNAR CaCO3 Gel de Sílice Resinas

TLC Ventajas: Desventajas: Sencillas Rápidas Bajo Costo Poco eficientes No automatizable Procesamiento de poca cantidad de muestra

COLUMNA Ventajas: Desventajas Versátiles Automatizables Mayor Resolución Mayor capacidad de carga Preparativa Desventajas Requiere personal capacitado Alto costo inicial

Clasificación según EQUILIBRIO PARTICIÓN  Soluto (Analito) en equilibrio entre el líquido de la FM y el de la FE en función de su diferencia de solubilidad ADSORCIÓN  Las partículas de soluto son adsorbidas en la superficie de las partículas de la FE y arrastradas por la FM INTERCAMBIO IÓNICO  Interacción entre los solutos iónicos y los grupos funcionales de la FE EXCLUSIÓN MOLECULAR  No hay equilibrio. Se separan por tamaño de partícula (tamiz molecular) AFINIDAD  El soluto interactúa como antígeno con un anticuerpo fijo en la FE

Cromatografía de PARTICIÓN En este caso el analito se “reparte” entre la FM y la FE en función de su solubilidad en cada una de ellas. Como la FE es un líquido adsorbido sobre un soporte sólido, esta cromatografía es Líquido-Líquido, y la distribución del analito depende de su Coeficiente de Parttición (P)

COEFICIENTE DE PARTICIÓN (O REPARTO) Cromatografía de PARTICIÓN COEFICIENTE DE PARTICIÓN (O REPARTO) Coeficiente de reparto o Partición (P): Cociente entre las concentraciones de un soluto (no iónizado) en dos fases de una mezcla formada por dos disolventes inmiscibles en estado de equilibrio. Cn-octanol Cagua Pow =

Cromatografía de PARTICIÓN FE (Adsorbida sobre el soporte) soporte inerte

Fenómeno de ADSORCIÓN Equilibrio dinámico = ADSORCIÓN  DESORCIÓN Fenómeno de Superficie ADSORCIÓN ABSORCIÓN

Equilibrio de INTERCAMBIO IÓNICO FE: Cargada negativamente FM: Buffer Soluto mas negativo: Eluye más rápidamente Soluto mas positivo: Eluye más lentamente

EXCLUSIÓN MOLECULAR

EQUILIBRIO DE AFINIDAD INMUNOCROMATOGRAFÍA

Clasificación según estado de la FASE MÓVIL LÍQUIDA (TLC, COLUMNA, HPLC, UPLC) GASEOSA (GC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Sistemas cromatográficos

Cromatografía de partición o reparto CL convencional Fase ligada El líquido (FE) está adsorbido sobre un soporte sólido inerte Las cadenas carbonadas (FE) están unidas covalentemente al soporte sólido inerte Fase inversa Fase móvil polar/ Fase estacionaria no polar Fase normal Fase móvil no polar/ Fase estacionaria polar

Cromatografía de adsorción Fase estacionaria sólida Fundamento de separación: el analito interacciona con sitios activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de hidrógeno, etc. Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO3, MgCO3

Fase unida o ligada La mayoría de las fases ligadas se forman a partir de partículas de sílicagel, a las que se les une covalentemente cadenas carbonadas que actúan como FE Representación esquemática de partícula de silicagel OH Si O HO grupo silanol

Empaques de siloxanos. Las fases ligadas más frecuentes (cepillo, oligomérica y voluminosa) son producidas por monocloro, dicloro y triclorosilanos, respectivamente. unión siloxano grupo silanol reactivo Si H O C 3 R Si O H Si C H 3 R Cl - HCl + unión siloxano alquil clorosilano C6H13 C8H17 C18H37 C4H6N C8H9SO etc

Fase unida tipo “cepillo” (brush) Los grupos están en posición perpendicular a la superficie generando una estructura de cepillo o brocha Estructura B Estructura A impedimento estérico (grupos metilos unidos al silicio) más aceptada

Fases ligadas Las fases tipo “cepillo” (brush) se sintetizan de una manera reproducible, y por lo tanto son generalmente recomendadas para la mayoría de las aplicaciones.

Ejemplos de fases ligadas reversas Hexil, C6 Octil, C8 Octadecil, C18 fenil Alquil fluorada (reactivo = perfluorooctil dimetil clorosilano)

Ejemplos de fases ligadas C-18 C8 C1 PFP Oxy-Phenyl (pentafluorofenil)

Fase reversa Más ampliamente utilizada Las fuerzas interactivas entre FE y soluto (o solvente) son de naturaleza dispersiva: fuerzas de dispersión de London (interacciones no polares, no iónicas). Solvente de alta polaridad-solutos de alta polaridad eluyen primero. R más comunes: C8 (n-octil) y C18 (n-octildecil) Cuanto mayor es el número de átomos de carbono en R mayor es la eficiencia. Elución a pH>7.5 puede producir hidrólisis del siloxano

Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia de la columna empacada con fase reversa 1 uracilo, 2 fenol, 3 acetofenona, 4 nitrobenceno, 5 metil benzoato, 6 tolueno R= C3 R= C8 R= C18

Fase normal FM de baja polaridad/ FE polar Solutos poco polares eluyen primero Incrementar la polaridad de la FM tiene el efecto de reducir el tiempo de elución. R-Polar: ciano, diol, amino, dimetilamino. FM de baja polaridad: etil éter, cloroformo, hexano

SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’) Índice de polaridad: describe cuantitativamente la polaridad del solvente en el reparto Fluoroalcanos < -2 Ciclohexano 0.04 Tolueno 2.4 Cloroformo 4.1 Etanol 4.3 Acetato de etilo 4.4 Metanol 5.1 Nitrometano 6.0 Etilenglicol 6.9 Agua 10.2 SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)

cromatografía de reparto Aplicaciones de la cromatografía de reparto CAMPO MEZCLAS TÍPICAS Fármacos Antibióticos, analgésicos, sedantes, esteroides Bioquímica Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos Alimentos Edulcorantes, aditivos, aflatoxinas, antioxidantes Industria química Aromáticos condensados, tensioactivos,colorantes Contaminantes Pesticidas, herbicidas, fenoles, HPAs Química forense Drogas, venenos, narcóticos, alcohol en sangre Medicina clínica Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos

Microscopía electrónica de barrido de soportes cromatográficos porosos sílica de forma irregular partículas esféricas de sílica monolítica de sílica polímeros orgánicos monolíticos

Cromatografía de adsorción Sílicagel O H Si solvente débil analito Si O H R solvente fuerte analito solvente

Solvente fuerte: sorción cloroformo n-heptano soluto sílica Solvente fuerte: sorción cloroformo n-heptano soluto sílica Solvente débil: desplazamiento

Sílica cubierta con bicapa de solvente Soluto interactuando con 2da capa de solvente B (sorción) Soluto interactuando con 1er capa de B (desplazamiento) Solvente B desplazado Solvente A desplazado sílica Soluto interactuando con 1er capa de A (sorción) Soluto interactuando con 1er capa de B (sorción) Soluto interactuando con sílica (desplazamiento) Soluto interactuando con sílica (desplazamiento)

Se produce un equilibrio entre fuerzas intermoleculares de soluto, FE y FM hidrocarburos<éteres<ésteres<cetonas<aldehídos<amidas<aminas< <alcoholes<agua Se elige la polaridad de FE bastante similar a la de los analitos y para eluir se usa FM de polaridad considerablemente distinta Polaridad creciente