O. G. Maksimenko, A.V. Deykin, Yu. M. Khodarovich, P. G. Georgiev. Eckers, Fabiana Glücksberg, Adriana Kleinbielen, Tamara Schneider, Rosio. Uso de animales transgénicos en Biotecnología: perspectivas y problemas

Conceptos generales  Transgénesis: procedimiento biotecnológico por el que se introduce un gen foráneo (transgen) en el genoma de un ser vivo.  Objetivo: se busca que el transgen se integre en la línea germinal (gametos) de una manera estable, asegurando así que el nuevo gen incorporado pueda ser heredado por la descendencia.

Aplicaciones  La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación.  Manipular de forma específica la expresión génica in vivo.  Estudiar la función de genes específicos.  Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteínas humanas y anticuerpos monoclonales.  La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica.

Principales métodos  Microinyección : es la introducción del transgén en el pronúcleo de un ovocito fertilizado.  Desventajas del método :  El transgén se introduce de forma aleatoria.  No todos los animales incorporan a su genoma el transgén.  El gen exógeno puede insertarse en un lugar erróneo.  Se produce un patrón variable de expresión del gen exógeno en la progenie transgénica, a menudo en mosaico.  En ocasiones, el transgén microinyectado no es heredable.

Transferencia nuclear celular  Consiste en introducir el material genético de la célula a clonar en un oocito de la misma especie previamente enucleado.  Limitaciones:  Incompatibilidad entre el estadio del núcleo y el citoplasma recipiente.  Formación de aneuploidias y otras aberraciones cromosómicas que provocan la muerte del embrión.  La evolución está ligada a la variabilidad genética mientras que la clonación tiende a la homogeneidad.  Expectativas de vida menores y envejecimiento prematuro de los individuos clónicos que también podrían tener una fertilidad reducida. Dolly (1997)

Células madre  Implica la inserción de un transgén en el genoma de la célula madre embrionaria, seguido por la selección de clones con una adecuada integración del número necesario de copias.  Las células madres embrionarias se introducen en la cavidad de un blastocisto, que se trasplanta en una hembra receptora.

Vectores Elementos genéticos móviles, que son integrados en el genoma por una transposasa. El gen que codifica la transposasa y el transgén flanqueado por repeticiones terminales del transposón son co-inyectados en el cigoto. La reacción catalizada por la transposasa da como resultado la integración de una sola copia del transgén en uno o varios sitios de genoma del animal..

La eficiencia de la integración del transgén depende del tipo de transposón la longitud de transgén, la concentración y el sitio de inserción del ADN. Sitio de inserción del ADN Cromatina de las inmediaciones normalmente ejerce una influencia negativa Varias copias del transgen integrados en el mismo sitio genómico, puede conducir a la represión de la transcripción por la formación de heterocromatina en secuencias repetitivas Normalmente en regiones pobres en genes en las que se caracterizan por rupturas frecuentes del ADN

Vector de expresión Región 5’ Potenciadores específicos de tejido Promotores Primeros exones no codificantes Intrones Extremo 3’ (UTR) Últimos exones e intrones no codificantes Sitio de poliadenilación Secuencias para terminación de transcripción

o El promotor del gen de β - caseína es uno de los más eficaces y se utiliza para la producción de proteínas en las glándulas mamarias de ratones, cabras y vacas. o E l vector comercial más popular para la producción de RPs en la leche de TAs - pBC1 (Invitrogen) posee este promotor.

Una serie de elementos reguladores se utilizan para proteger la expresión de los transgenes de la represión y para mantener la relación directa entre el número de copias y el nivel de expresión del transgén en cultivos de células de mamíferos. Se utilizan en construcciones de vectores para producir TA Aisladores

Transgen Un gen completo Un cDNA Un mini -gen con algunos de los intrones El uso de un gen con una estructura exón - intrón no modificada permite obtener niveles mucho más altos de proteína en la producción de TA. Objetivo

La expresión de los genes que son una parte de la estructura del bácmido puede afectar negativamente la salud del TA. Además no se suprime completamente el efecto de la genómica alrededores. Integración de un gran segmento de ADN (hasta 250 kb) en el genoma. Vectores basado en cromosomas artificiales bacterianos ( bácmidos ). Se logra la expresión estable del transgen a un nivel similar que la de los genes nativos. Problema Ventaja

 Son aquellas que se obtienen por la expresión de un gen clonado de una especie o línea celular particular en otra línea celular que nos interesa.  Según la complejidad de la proteína a producir se elegirá un organismo u otro: levaduras, bacterias, mamíferos, etc.

Tener en cuenta!!! Expresar una proteína de un determinado organismo en otro puede tener consecuencias, como cambios de conformación o distintas modificaciones postraduccionales que pueden ocasionar que la proteína no funcione como debe.

Ventajas  Obtención de proteínas de distintos orígenes en organismos fácilmente cultivables.  Obtención de grandes cantidades del producto de forma fácil y reproducible, en comparación la obtención por extracción a partir de su fuente natural.  Productos libres de patógenos y otros riesgos potenciales.  Pueden producirse proteínas que no existen en la naturaleza.

Ejemplos de proteínas recombinantes  Factores de coagulación VII, VIII y IX  Albúmina  Factor estimulante de colonias de granulocitos.

Producción de PRS en TAs Se busca generar PR sin que afecten negativamente a la lactancia y la salud de la TA, para lo cual se proponen los siguientes enfoques Promotor que funciona establemente sólo en la glándula mamaria en un nivel relativamente bajo Vector adenoviral Producción de las formas inactivas de las proteínas(proteína quimérica)

Es un anticuerpo homogéneo producido por una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral.

Ventajas sobre los anticuerpos policlonales Mayor homogeneidad. Reproductibilidad de sus efectos. Mayor capacidad potencial de seleccionar los mejores anticuerpos en afinidad, tipo de reconocimiento.

 En la actualidad los mAB utilizados en la medicina se producen exclusivamente en cultivos de células de mamíferos. Requieren modificaciones post-traduccionales adecuadas para garantizar la eficacia terapéutica, que aumentan considerablemente tiempo de circulación en el torrente sanguíneo y reducir su inmunogenicidad.

Uso potencial de animales transgénicos en la agricultura FDA está a punto de aprobar la comercialización de salmón transgénico que expresa la hormona del crecimiento. Ventaja: doble de aumento en el crecimiento. Costo

Aplicación comercial de diversos animales transgénicos  producción de leche modificada que contenga RPs humanas;  alteración de la composición de leche para aumentar la eficiencia en la producción de lácteos,  mejora de las características de animales de granja,  mejora de la resistencia de los animales de granja a bacterias, virus, priones e infecciones.

Alimentación infantil y nutrición artificial de recién nacidos Leche materna ≠  Mayor concentración de lactoferrina, lisozima y lactoalbúmina.  Protegen al organismo contra las infecciones, mejoran la estructura del epitelio intestinal, tienen un efecto positivo sobre la microflora intestinal, y mejoran la inmunidad.

 20 % en el nivel de expresión de β - caseína y un aumento del doble en síntesis k – caseína.  Reducción en el tamaño micelar y aumentos térmicos la estabilidad, que es necesaria para la producción de queso.

 Insuficiente contenido de α- lactoalbúmina en la leche cerdos transgénicos con el gen α - lactalbúmina de vaca insertados en su genoma.  Nivel de fosfatos en las heces gen de origen bacteriano de codificación de fitasa.

Enfermedades  Mastitis leche contiene lisostafina.  Encefalopatía espongiforme bovina eliminación del gen que codifica para la proteína prión.