Microbiología de Alimentos Q.B.P María Eugenia Alarcón Sáenz 235962

1 Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela. 2 Ministerio del Poder Popular para la Alimentación. Caracas, Venezuela. a Magíster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos; b licenciada en Biología; c licenciado en Ciencias de los Alimentos. Recibido: : 11-01-14 Aprobado: 23-07-14 Citar como: Palomino-Camargo C, González-Muñoz Y. Técnicas moleculares para la detección e identificación de patógenos en alimentos: ventajas y limitaciones. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2014;31(3):535-46.

INTRODUCCIÓN ETA problema de salud a nivel mundial 98% m.o encontrados en los alimentos no son patógenos Importante para la agricultura, la industria y consumidores Métodos microbiológicos clásicos: Cultivo de enriquecimiento Aislamiento en medios selectivos Posterior confirmación con pruebas bioquímicas Resultados en días o semanas Baja sensibilidad Bacterias en estado viable pero no cultivable (VPNC) en alimentos.

El uso de métodos moleculares Pruebas de diagnóstico que pueden detectar específicamente el microorganismo de interés Métodos rápidos y sensibles para la detección, identificación y cuantificación de patógenos transmitidos por alimentos.

OBJETIVO Describir los distintos métodos moleculares utilizados para la detección, e identificación de microorganismos patógenos transmitidos por alimentos, haciendo particular énfasis en sus ventajas y limitaciones.

METODOLOGÍA Se realizo una revisión de tipo narrativa, no sistemática, referente a las técnicas moleculares utilizadas actualmente en la detección e identificación de patógenos en alimentos, destacando a la vez, sus aplicaciones, ventajas y limitaciones. La recolección de la información se efectuó durante noviembre y diciembre de 2013. La búsqueda se llevó a cabo en las bases de datos: Science Direct Springer Journal Medline.

Métodos moleculares para la detección e identificación de patógenos transmitidos por alimentos La identificación molecular se basa en la composición de los ácidos nucleicos Primeros avances 1980 Hibridación ADN-ADN Análisis de secuencias del ADNr Análisis ribotipificación (RFLP) Segunda generación de métodos moleculares: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) PCR múltiple Secuenciación de genes específicos Análisis de restricción del ADNr amplificado

Aplicación de técnicas moleculares en la detección e identificación de patógenos transmitidos por alimentos

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Se basa en el principio de complementariedad de bases del ADN y en la participación de la enzima polimerasa que permite la extensión del fragmento a amplificar, agregando nucleótidos en secuencia complementaria al ADN molde por medio de un proceso cíclico Comprende tres pasos: Desnaturalización Hibridación Extensión Técnica mas utilizada debido a su protocolo rápido y fácil uso Son necesarias de 2-3 h

Aplicaciones de PCR: Un estudio realizado por Gous y Ledemann (2005) utilizaron PCR específico para el gen hly de L. monocytogenes, y los métodos de cultivo convencionales, para analizar 27 productos de leche. RESULTADOS: 74% fueron positivos en agar Ocford 37% positivos en PCR Es posible identificar una única célula de C. jejuni en muestras de leche y agua por PCR junto con técnica de separación inmunomagnética (IMS) La PCR dirigida a los genes genes flaA, CadF, ceuE y cdt y la región 16S del ARNr. Tiempo de ensayo: 8 horas, sin enriquecimiento de la muestra. Los autores concluyeron que la PCR eliminó falsos positivos que se observaron por los métodos de cultivo.

PCR múltiple Desarrollada para la detección simultánea de dos o más agentes patógenos asociados a alimentos. Un ensayo de PCR múltiple para la detección de Salmonella spp, L. monocytogenes y E. coli O157:H7, luego de un cultivo de enriquecimiento, tuvo un limite de detección de 1 UFC/g de carne de cerdo, en un tiempo de 30 h. Se han desarrollado métodos de PCR para detectar genes que codifican toxinas o factores de virulencia (lo que convierte a las bacterias en patógenas).

Tiempo de resultados: 2 días. PCR en tiempo real Se han desarrollado para patógenos de origen alimentario, ofreciendo una detección rápida, sensible y específica de una serie de agentes patógenos. Facilidad de uso Automatización Tiempo de resultados: 2 días. Existe un numero creciente de kits de PCR en tiempo real, disponibles comercialmente.

Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) Detectan ARNm de patógenos asociados a alimentos Capacidad para detectar organismos viables Sensibilidad a tiempo real deficiente No diferenciación ente ARN y ADN.

Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) Se ha utilizado satisfactoriamente en la tipificación de Salmonella, aislada a partir de alimentos de origen animal y pacientes humanos. Ha sido extensamente utilizada a nivel mundial para: La vigilancia e investigación de los brotes de E. coli O157:H7 Trazado de las vías de transmisión Rastreo de las fuentes de brotes de restaurantes, granjas, aguas contaminadas, animales, humanos y/o equipos. La Pulse-Net EE.UU ha estandarizado protocolos de PFGE para E. coli O157, S. entérica, Shigella spp., L. monocytogenes, Campylobacter spp. y V. cholerae

Biosensores Los biosensores ópticos que utilizan una señal fluorescente son los mas comunes. Biosensores: anticuerpos, bacteriófagos, electroquímicos. Transductor piezoeléctrico  frecuencia en la resonancia  numero de células capturadas. Resultados 1 hora.

Microarreglos Consisten en un gran numero de sondas (clones de ADN, productos de la PCR u oligonucleótidos sintéticos) inmovilizadas sobre una superficie solida. Tras los pasos de hibridación y lavado, el ácido nucleico enlazado a las sondas genera un patrón de fluorescencia que es registrado y analizado utilizando un escáner. Microarreglo particular basados en el gen gyrB, utilizado para detectar e identificar a Salmonella y Shigella. Pueden identificar un amplio rango de bacterias patógenas y ayudar a la caracterización de la resistencia antimicrobiana y los genes de virulencia presentes, logrando gran sensibilidad y especificidad.

Pirosecuenciación 454 Una nueva herramienta para la detección de patógenos en alimentos y medioambiente Secuenciación rápida y de alto rendimiento Los genomas pueden ser completamente secuenciados en semanas (incluso horas), en lugar de años, debido a que esta metodología no requiere bibliotecas de ADN, ni clones, solo el ácido nucleico aislado. Ha ampliado el repertorio de los genomas bacterianos secuenciados y ha ayudado a identificar los agentes potenciales, bacterianos, protozoarios o virales, asociados con enfermedades de etiología desconocida

Ventajas y limitaciones de las técnicas moleculares

CONCLUSIONES Las técnicas de diagnóstico molecular representan una alternativa prometedora en el campo de lo alimentos, debido a su rapidez, elevada sensibilidad y eficiencia para la detección temprana de microorganismos patógenos. La PCR destaca como el método de diagnóstico molecular mas aplicado en el área de alimentos. Las variaciones de PR han sumado ventajas a esta técnica, entre las que destacan mayor velocidad en la obtención de resultados. Los equipos y reactivos resultan mas costosos que aquellos empleados en los métodos tradicionales de cultivo. La estandarización y normalización de estos métodos son un requisito indispensable para lograr la aplicación práctica y rutinaria de estas técnicas.

Gracias