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Perspectives and Limits in Enology Research Levaduras genéticamente modificadas como vectores de ingeniería enológica durante la fermentación. Perspectivas.

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1 Perspectives and Limits in Enology Research Levaduras genéticamente modificadas como vectores de ingeniería enológica durante la fermentación. Perspectivas de nuevos productos Sergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiology Sergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiology Ramón González: Filling the gap between fundamental yeast research and applied wine biotechnology Ramón González: Filling the gap between fundamental yeast research and applied wine biotechnology Sylvie Dequin: Metabolic engineering of wine yeasts to reduce the ethanol yield: challenges and perspectives Sylvie Dequin: Metabolic engineering of wine yeasts to reduce the ethanol yield: challenges and perspectives

2 Sylvie Dequin: Metabolic engineering of wine yeasts to reduce the ethanol yield: challenges and perspectives Research Director at the Sciences For Enology unit at INRA, Montpellier. Since her recruitment at INRA in 1986, she became interested in physiology and genetics of wine yeasts, from both fundamental and applied perspectives. As early as in the 1990s, she developed innovative work in the field of metabolic engineering of wine yeasts. More recently, she pursued her research in the field of genomics and systems biology applied to wine strains. Her team has, in particular, recently completed the sequencing of the genome of a first commercial wine strain.

3 Ramón González: Filling the gap between fundamental yeast research and applied wine biotechnology Se inició en el Departamento de Microbiología de la Universitat de València con Sergi Ferrer y Daniel Ramón, desarrollando métodos de transformación para hongos (1989). Tesis Doctoral en el IATA (CSIC), entre el 90 y el 93, desarrollando métodos de transformación para levaduras industriales, construyendo una de las primeras levaduras vínicas transgénicas (y la primera encaminada a mejorar una propiedad sensorial del vino). Postdoc de más de cuatro años en París, más biología molecular de hongos. Investigador del CSIC en el IFI desde 1999 a Autofagia y autolisis, y mejora genética de levaduras de segunda fermentación. Actualmente está en el Instituto de Ciencias de la Vid y del Vino (centro mixto del CSIC, la U. de La Rioja y el Gobierno de La Rioja). Genética de la liberación de manoproteínas y construcción de levaduras mejoradas para esta. Metabolismo de las levaduras durante la fermentación alcohólica. Además de artículos científicos, es coautor de varias patentes sobre métodos de mejora genética de levaduras vínicas, tanto convencionales como por ingeniería genética.

4 Sergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiology Comencé en el Departamento de Microbiología de la Universitat Autònoma de Barcelona en genética de Salmonella. Profesor Ayudante hasta Becario predoctoral y Tesis en la Universitat de València en 1984, sobre mutagénesis, fusión de protoplastos y métodos de manipulación genética en hongos. Premio extraordinario de Doctorado Profesor Titular en la Universitat de València desde Administrador de la lista de correo Gienol y miembro fundador. Formo parte del grupo ENOLAB, que se ocupa de aspectos microbiológicos relacionados con la enología en varias vertientes: caracterización de la microbiota, selección de microorganismos, taxonomía, FML, acidificación biológica, genética, aminas biógenas. He participado en 21 Proyectos de I+D nacionales y europeos financiados en Convocatorias públicas (9 de ellos como Investigador Principal), en 10 contratos de I+D de relevancia con empresas (liderando 8 de ellos.

5 Perspectives and Limits in Enology Research Levaduras genéticamente modificadas como vectores de ingeniería enológica durante la fermentación. Perspectivas de nuevos productos Sergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiology Sergi Ferrer: Towards the future of oenological microbiology

6 Métodos genéticos para la mejora de levaduras de vinificación Selección de variantes: debida a mutación espontánea. Requiere métodos de selección. No se han logrado mejoras importantes. Mutagénesis: aumenta la frecuencia de mutantes. Efecto de la ploidía de las cepas. Mejoras limitadas, pero evitan los OMG. Hibridación: incluye distintas variantes (rare mating, citoducción, fusión de protoplastos, etc.). Método efectivo de mejorar y combinar caracteres poligénicos. Se pueden evitar los OMG. Transformación: empleo de la ingeniería genética para cambiar propiedades específicas. Modificación o introducción de nuevas características. Supone el término OMG.

7 Guidici et al. 2005

8 Mutagénesis al azar Ingeniería evolutiva (evolución dirigida) Ingeniería metabólica Estrategias metagenómicas Barajado de genomas Guidici et al. 2005

9 OBJETIVOS DE LA MEJORA GENÉTICA DE LEVADURAS ENOLÓGICAS Propiedades deseadas ÁreasEjemplos Mejora de la fermentación Resistencia y tolerancia al estrés Respuesta al estrés. Acumulación de glucógeno, esteroles y trehalosa Mejora de la utilización de azúcares Transportadores de hexosas Mejora de la asimilación de nitrógeno Genes de catabolismo de aminoácidos Mejora de la tolerancia al etanol Formación de esteroles, actividad ATPasa Aumento de la tolerancia a antimicrobianos Resistencia a SO 2, killer, agroquímicos Reducción de la formación de espuma Proteínas de superficie celular

10 Propiedades deseadas ÁreasEjemplos Mejora de procesos Clarificación de proteínasSobreexpresión de proteasas Clarificación de polisacáridos Sobreexpresión de glucanasas, pectinasas, etc. Sedimentación y floculación de células Expresión de floculinas Flotación y formación de flor Proteínas hidrofóbicas de membrana OBJETIVOS DE LA MEJORA GENÉTICA DE LEVADURAS ENOLÓGICAS

11 Propiedades deseadas ÁreasEjemplos Mejora de aspectos saludables Aumento resveratrolSíntesis estilbeno Reducción etil carbamatoMetabolismo aminoácidos Reducción aminas biógenas Bacteriocinas y enzinas bacteriolíticos Capacidades de biopreservación Enzimas y péptidos antimicrobianos. Sulfitos Bajos niveles de etanolFlujo de carbono (glicerol) OBJETIVOS DE LA MEJORA GENÉTICA DE LEVADURAS ENOLÓGICAS

12 Propiedades deseadas ÁreasEjemplos Mejora de aromas y cualidades sensoriales Liberación terpenoides de la uva Glucanasas, glicosidasas, arabinofuranosidasas Aumento producción ésteres volátiles Esterasas Producción optimizada alcoholes fusel Metabolismo aminoácidos Aumento producción glicerol Metabolismo glicerol Acidificación biológicaProducción ácidos DesacidificaciónFermentaciones maloláctica y maloalcohólica Reducción producción sulfitos Metabolismo del azufre (y del nitrógeno) OBJETIVOS DE LA MEJORA GENÉTICA DE LEVADURAS ENOLÓGICAS

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14 La Fermentación Maloláctica Transgénica Williams S.A., Hodges R.A., Strike T.L., Snow R. & Kunkee R.E Cloning the Gene for the Malolactic Fermentation of Wine from Lactobacillus delbrueckii in Escherichia coli and Yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 47: 288–293. Snow, R Genetic engineering of a yeast strain for malolactic fermentation of wine. Food Technol. 39: Clonan un gen de Lactobacillus delbrueckii en el plásmido pBR322, obteniendo dos clones de E. coli capaces de convertir L-malato en L-lactato. Y logran transferir el gen a un vector para levaduras…..

15 PERO…… 'Plasmid instability seems to be one problem that affects gene expression, as our strains of E. coli and yeast rapidly lose the malolactic function upon transfer'

16 Lautensach, A. & Subden, R.E Cloning of malic acid assimilating activity from Leuconostoc oenos in E. coli. Microbios 39: 'low probability of religation, instability, and transient expression of genes from Leuconostoc oenos in E. coli' Our results show that genes from Leuconostoc oenos can be transiently expressed in E. coli. Whether the instability is due to insert size, host restriction or other events will be subject to further studies. Clonan un gen de asimilación de malato mediante el vector pTR262 (derivado de pBR322). Los transformantes (que crecen solamente con malato) resultan genéticamente inestables. Los plásmidos quedan alterados por procesos recA independientes. El clon se pierde.

17 Renault P Clonage de l'enzyme malolactique de bactéries lactiques et son transfert dans une souche de Saccharomyces cerevisiae. Journée de Rencontres Œnologiques. Montpellier, 25 Janvier. Renault P., Gaillardin C. & Heslot H Product of the Lactococcus lactis gene required for malolactic fermentation is homologous to a family of positive regulators. J. Bacteriol. 171: Clonan un presunto gen FML de Lactococcus lactis en pIL725 (derivado de pAMß1), pero resulta ser un regulador. Zúñiga M. & Ferrer S. (resultados sin publicar). Ese regulador no hibrida con DNA de Oenococcus oeni (L. oenos).

18 Ansanay V., Dequin S. & Barre P Clonage et expression du gène de lenzyme malolactique de Lactococcus lactis. Eur Patent Ansanay V., Dequin S., Blondin B. & Barre P Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactis. FEBS Lett. 332: 74–80. Ansanay V., Dequin S., Camarasa C., Schaeffer V., Grivet J.P., Blondin B., Salmon J.M. & Barre P Malolactic fermentation by engineered Saccharomyces cerevisiae as compared with engineered Schizosaccharomyces pombe. Yeast 12: 215–225. Denayrolles M., Aigle M. & Lonvaud-Funel A Cloning and sequence analysis of the gene encoding Lactococcus lactis malolactic enzyme: relationships with malic enzymes. FEMS Microbiol. Lett. 116: 79–86. Denayrolles M., Aigle M. & Lonvaud-Funel A Functional expression in Saccharomyces cerevisiae of the Lactococcus lactis mleS gene encoding the malolactic enzyme. FEMS Microbiol. Lett. 125: 37–44. Clonaje y expresión eficiente del gen maloláctico de L. lactis en S. cerevisiae.

19 Labarre C., Guzzo J., Cavin J.F. & Diviès, C Cloning and characterization of the genes encoding the malolactic enzyme and the malate permease of Leuconostoc oenos. Appl. Environ. Microbiol. 62: Clonaje del gen maloláctico de O. oeni (L. oenos). Genes organizados en cluster.

20 Coexpresión del enzima maloláctico junto con la malato permeasa de Schizosaccharomyces pombe. Grobler J., Krizus A., Osothsilp-De-Eknamakul C., Pretorius I., van Vuuren H.J.J. & Subden R.E A method and nucleotide sequence for transforming microorganisms. Int Patent WO 96/36715 Bony M., Bidard F., Camarasa C., Dulau L., Barre P. & Dequin S Complete malolactic fermentation by S. cerevisiae strains expressing heterologous genes for malolactic enzyme and malate transport. FEBS Lett. 410: 452–456. Volschenk H., Viljeon M., Grobler J., Bauer F., Lonvaud-Funel A., Denayrolles M., Subden R.E. & van Vuuren H.J.J Malolactic fermentation in grape musts by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae. Am. J. Enol. Vitic. 48: 193–197. ÉXITO!

21 ¿Y en bacterias?

22 La genética en Oenococcus oeni O'Sullivan T. & Daly C Plasmids in Leuconostoc species. J. Appl. Bacteriol. 64: Esta especie posee pocos plásmidos, y son crípticos. Tiene características extrañas: taquitélico, no repara apenas mutaciones, sus fagos son relativamente abundantes y muy semejantes (¿una especie de fago solamente?), y es bastante refractaria a la manipulación genética convencional.

23 La conjugación en Oenococcus oeni: transposones Zúñiga M., Pardo I. & Ferrer S Transposons Tn916 and Tn925 can transfer from Enterococcus faecalis to Leuconostoc oenos. FEMS Microbiol Lett 135: MatingFrequency per donor cellFrequency per recipient cell CG180 x x x10 -8 CG180 x x x10 -8 CG180 x x x10 -6 CG110 x x x10 -6 CG180 x 872ND1.9x10 -8 CG180 x 873ND1.2x10 -6 CG180 x 874ND1.3x10 -6 CG110 x x10 -5 ND Los transposones son estables en O. oeni.

24 La conjugación en Oenococcus oeni: plásmidos Zúñiga M., Pardo I. & Ferrer S Conjugative plasmid pIP501 undergoes specific deletions after transfer from Lactococcus lactis to Oenococcus oeni. Arch. Microbiol. 180: Primera transferencia de plásmidos a la especie. Pero……

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27 La transformación en Oenococcus oeni: una larga historia Muchos años, muchos grupos, pocos éxitos…..y alguna que otra sorpresa

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30 ¿Hacia dónde vamos ahora?

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32 Perspectives and Limits in Enology Research Levaduras genéticamente modificadas como vectores de ingeniería enológica durante la fermentación. Perspectivas de nuevos productos Propuestas de discusión

33 El problema de la falta de control microbiológico en los vinos No se aíslan normalmente microorganismos patógenos en el vinoNo se aíslan normalmente microorganismos patógenos en el vino No existe legislaciónNo existe legislación ¿Falta formación de los técnicos?¿Falta formación de los técnicos? ¿Falta de confianza en los científicos y en los resultados?¿Falta de confianza en los científicos y en los resultados? Creencia de que son análisis caros e innecesariosCreencia de que son análisis caros e innecesarios No es un problema de sustitución de metodologías, sino de introducción en el sectorNo es un problema de sustitución de metodologías, sino de introducción en el sector

34 BARRERAS CONTRA LA COMERCIALIZACIÓN DE LEVADURAS Y BACTERIAS ENOLÓGICAS RECOMBINANTES Científicas y tecnológicas: complejidad del vino y de las cepas, requerimientos de los productores y consumidores. Legales y regulatorias: aprobación OMG, definición completa de las secuencias de DNA. Propiedad intelectual y patentes: las patentes pueden restringir la libertad de operación. La liberación de OMGs puede ir en detrimento de la comercialización (de las cepas y los vinos). Políticas y económicas: interferencia de los proteccionismos. Establecimiento de barreras. Tradicionales y culturales: Etiquetados específicos. Posibilidad del marcaje como libre de OMGs. Percepción pública: Miedo a efectos en un futuro, daños en el medio ambiente y pérdida de la biodiversidad.

35 ¿Necesitamos los OMG? ¿Necesitamos más herramientas de manipulación genética? Las administraciones y organismos oficiales, ¿están o estarán implicadas en este tema? ¿Deberían estarlo? ¿Cómo puede esta tecnología llegar a las bodegas? ¿Podemos impulsar la aceptación y la regulación de estas tecnologías? ?Cómo hacerlo? ¿Existe realmente una diferente visión para los viejos y nuevos países productores? ¿Puede llegar algún día la Revolución Microbiana? Algunas propuestas…

36 Successful application of recombinant DNA technology in the wine industry will depend on assuring commercial users of genetically modified wine yeasts that existing desirable characteristics have not been damaged, that the requirements of beverage legislation are met, and that the engineered strain will be stable in practice, with suitable procedures for monitoring. The first recombinant wine products should unequivocally demonstrate organoleptic, hygienic and economic advantages for the wine producer and the consumer.

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38 ENOLAB


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