VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

Presentación del tema: "VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS"— Transcripción de la presentación:

1 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Alvaro Codas Agosto VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS

2 NORMA ISO “Requisitos Generales para la Competencia de los Laboratorios de Ensayo y Calibración” Contiene todos los requisitos que tienen que cumplir los laboratorios de ensayo y de calibración si desean demostrar que poseen un sistema de gestión, son técnicamente competentes y son capaces de generar resultados técnicamente válidos.

3 NORMA ISO 17025 Se divide en los capítulos:
1 Objetivo y Campo de Aplicación 2 Referencias Normativas 3 Términos y Definiciones (Norma y del VIM) 4 Requisitos Relativos a la gestión (organización, sistema de gestión, control d documentos, Revisión de pedidos, ofertas y contratos, compras de servicios y suministros, servicio al cliente, Quejas, auditorias internas etc.) 5 Requisitos Técnicos (personal, instalaciones y condiciones ambientales, métodos de ensayo y de calibración y VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS)

4 VALIDACIÓN ISO 17025:2005 Confirmación, mediante el examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto ( ).

5 ISO 17025 (5.4.5.2) Validar Métodos No Normalizados
Métodos desarrollados por el laboratorio Métodos Normalizados empleados fuera del alcance previsto, o modificaciones de los mismos.

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7 ISO 17025:2005 (Nota 42) Es conveniente:
Utilización de patrones de referencia o materiales de referencia Comparación de resultados obtenidos con otros métodos Comparaciones interlaboratoriales Evaluación sistemática de los factores que influyan en el resultado Evaluación de la incertidumbre de los resultados basada en el conocimiento científico de los principios teóricos del método y en la experiencia práctica.

8 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Procedimiento para establecer por medio de estudios laboratoriales una base de datos que demuestren científicamente que un método analítico tiene las características de desempeño que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. Implica la demostración de la determinación de las fuentes de variabilidad y del error sistemático y al azar de un procedimiento, no solo dentro de la calibración sino en el análisis de muestras reales.

9 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
MÉTODO ANALÍTICO: adaptación específica de una técnica analítica para un propósito de medición seleccionado. PARAMETROS DE DESEMPEÑO ANALITICO: Características de validación que necesitan ser evaluadas y típicamente son: exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, intervalo de linealidad y robustez.

10 Validación de métodos analíticos - guias
Guía Q2 International Conference of Harmonisation (ICH). Guidelines for the Validation of Chemical Methods for the FDA Foods Program (Food and Drug Administration) AOAC INTERNATIONAL Guidelines for Validation of Botanical Identification Methods HARMONIZED GUIDELINES FOR SINGLELABORATORY VALIDATION OF METHODS OF ANALYSIS (IUPAC) Validation of Compendial Methods – Verification of Compendial Methods (USP)

11 CONCEPTOS ESTADÍSTICOS
Medidas de Tendencia Central Media Mediana Moda Medidas de Variación Rango Varianza Desviación Estándar (y desviación estándar relativa o %RSD)

12 MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL
MEDIA: es la suma de todos los valores dividido por el número de valores. Para una muestra: Donde (X) representa la Media para la muestra, (n) el tamaño de la muestra y (Xi) representa cada uno de los valores observados.

13 MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL
MEDIANA: Con esta medida podemos identificar el valor que se encuentra en el centro de los datos, es decir, nos permite conocer el valor que se encuentra exactamente en la mitad del conjunto de datos después que las observaciones se han ubicado en serie ordenada.

14 MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL
MODA: La medida modal nos indica el valor que más veces se repite dentro de los datos. Ej: si tenemos la serie ordenada (2, 2, 5 y 7), el valor que más veces se repite es el número 2 quien seria la moda de los datos. Es posible que en algunas ocasiones se presente dos valores con la mayor frecuencia, lo cual se denomina Bimodal o en otros casos más de dos valores, lo que se conoce como multimodal.

15 ERROR ERROR SISTEMÁTICO: Como su nombre indica, no son debidos al azar o a causas no controlables. Pueden surgir de emplear un método inadecuado, un instrumento defectuoso o bien por usarlo en condiciones para las que no estaba previsto su uso. Las causas pueden ser la siguientes: Errores instrumentales (de aparatos). Error personal. Este es, en general, difícil de determinar y es debido a limitaciones de carácter personal. Un ejemplo de éste sería una persona con un problema de tipo visual. Error de la elección del método. Corresponde a una elección inadecuada del método de medida de la magnitud. Este tipo de error puede ponerse de manifiesto cambiando el aparato de medida, el observador, o el método de medida.

16 ERROR ERROR ALEATORIO (ACCIDENTAL): Son incertidumbres debidas a numerosas causas incontrolables e imprevisibles que dan lugar a resultados distintos cuando se repite la medida en condiciones idénticas. Son errores debidos al azar. Aunque la presencia de los errores accidentales no pueda evitarse, sí puede estimarse su magnitud por medio de métodos estadísticos.

17 Medidas de Variación RANGO: es la diferencia entre el mayor valor y el menor valor del grupo de muestras. DESVIACIÓN ESTÁNDAR: es la raíz cuadrada de la varianza. A su vez, la varianza equivale al promedio de las desviaciones o diferencias cuadráticas de cada valor de una serie con respecto al promedio de esa serie. En un conjunto de datos es una medida de dispersión, que nos indica cuánto pueden alejarse los valores respecto al promedio (media).

18 Medidas de Variación DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA (%RSD)
Desviación estándar relativa (RSD) se calcula al dividir la desviación estándar entre el promedio de la serie de datos. RSD se expresa en partes por mil (ppmil) o en porcentaje, multiplicando esta relación por 1000 o por 100, respectivamente.

19 CALCULOS ESTADISTICOS
PRUEBA F de SNEDECOR-FISHER (Análisis de Varianzas): Es una distribución de probabilidad de gran aplicación en la inferencia estadística, fundamentalmente en la contrastación de la igualdad de varianzas de dos poblaciones normales, y, fundamentalmente en el análisis de varianzas, técnica que permite detectar la existencia o no de diferencias significativas entre muestras diferentes y que es, por tanto esencial, en todos aquellos casos en los que se quiere investigar la relevancia de un factor en el desarrollo y naturaleza de una característica.

20 PRUEBA F DE SNEDECOR-FISHER
Es una prueba estadística empleada para la comparación de varianzas. Sean 2 conjuntos de datos: Consideramos la hipótesis nula que dice que las varianzas no presentan diferencias significativas entre sí. Y se compara con Ftab(0,05)

21 PRUEBA F DE SNEDECOR-FISHER
Si F<Ftab admitimos H0

22 HERRAMIENTAS DE CALCULO
Minitab Excel

23 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS - DEFINICIONES
ESPECIFICIDAD: Habilidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de componentes que se puede esperar que estén presentes. Típicamente éstos pueden incluir impurezas, productos de degradación, la matriz, etc. EXACTITUD: (VERACIDAD): Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea como un valor convencional verdadero (material de referencia interno de la firma), sea como un valor de referencia aceptado (material de referencia certificado o estándar de una farmacopea) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto número de veces. INTERVALO DE LINEALIDAD: Ámbito entre la menor y la mayor concentración de analito en la muestra (incluyendo éstas concentraciones) para las cuales se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene el nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad. LIMITE DE CUANTIFICACION: Cantidad más pequeña del analito en una muestra que puede ser cuantitativamente determinada con exactitud aceptable. Es un parámetro del análisis cuantitativo para niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa particularmente para impurezas y productos de degradación. Se expresa como concentración del analito.

24 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS - DEFINICIONES
LIMITE DE DETECCION: Cantidad más pequeña de analito en una muestra que puede ser detectada por una única medición, con un nivel de confianza determinado, pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto. Es comúnmente expresado como concentración del analito. LINEALIDAD: Habilidad (dentro de un ámbito dado) del procedimiento analítico de obtener resultados de prueba que sean directamente proporcionales a la concentración de analito en la muestra. MATERIAL DE REFERENCIA (PATRÓN TERCIARIO): Material o sustancia, en el cual una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas para que sea usado en la calibración de un aparato, la estimación de un método de medición o para asignar valores a los materiales. MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (PATRÓN SECUNDARIO): Material en el que los valores de una o más de sus propiedades están certificados por un procedimiento técnicamente validado, bien sea que este acompañado de, o pueda obtenerse, un certificado u otra documentación emitida por un ente certificador. MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIA (PATRÓN PRIMARIO): Material emitido por la Oficina Nacional de Normas de Estados Unidos (U.S National Bureau of Standars) cuyo nombre fue cambiado recientemente a Instituto Nacional para Normas y Tecnología (National Institute for Standards and Technology, NIST.)

25 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS - DEFINICIONES
PRECISION: expresa la cercanía de coincidencia (grado de dispersión) entre una serie de mediciones obtenidas de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea bajo condiciones establecidas. Puede considerarse a tres niveles: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad. Debe determinarse utilizando muestras originales y homogéneas. Sin embargo, si no es posible obtener una muestra homogénea puede ser determinada usando muestras preparadas o una disolución de la muestra. PRECISION INTERMEDIA: Precisión obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, días distintos con la misma muestra homogénea. PROCEDIMIENTO ANALITICO: Forma en que se realiza el análisis. Debe describir en detalle los pasos necesarios para realizar cada prueba analítica. Puede incluir, pero no necesariamente los siguientes conocimientos: características de la muestra, preparación de los estándares de referencia y reactivos, uso de los aparatos o instrumentos, generación de la curva de calibración, uso de fórmulas para los cálculos. PROCEDIMIENTO ANALITICO OFICIAL: Procedimiento analítico estandarizado contenido en una farmacopea oficial o libros oficiales. Se les supone validados y los laboratorios que los utilizan no están obligados a validar la exactitud de los mismos, solamente demostrar su aptitud para aplicarlos, validando la linealidad y precisión del sistema. REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en un intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y en el mismo equipo. REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisión entre laboratorios como resultado de estudios interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.

26 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS - DEFINICIONES
ROBUSTEZ: Medida de la capacidad de un procedimiento analítico de permanecer inafectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee una indicación de su fiabilidad en condiciones de uso normales. SELECTIVIDAD: Describe la habilidad de un procedimiento analítico para diferenciar entre varias sustancias en la muestra y es aplicable a métodos en los que dos o más componentes separados y cuantificados en una matriz compleja. SESGO: Se usa en el sentido de exactitud de un promedio a largo plazo (valor esperado) de una serie de promedios. Es la diferencia en el valor esperado (teóricamente igual al promedio de un número infinito de valores individuales independientes) del valor verdadero, correcto o asumido. SISTEMA ANALITICO: Está compuesto por: equipos, reactivos, materiales, documentos, patrones, materiales de referencia, analistas y variables operativas, que se utilizan en un método de análisis. TECNICA ANALITICA: Principio científico que se ha encontrado útil para proveer información sobre la composición de un determinado producto o material VALIDACIÓN: Confirmación que se da por la recopilación y análisis de la evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para el uso específico propuesto. VALIDACIÓN DE UN PROCEDIMIENTO ANALITICO: Procedimiento para establecer por medio de estudios laboratoriales una base de datos que demuestren científicamente que un método analítico tiene las características de desempeño que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. Implica la demostración de la determinación de las fuentes de variabilidad y del error sistemático y al azar de un procedimiento, no solo dentro de la calibración sino en el análisis de muestras reales.

27 PROTOCOLO DE VALIDACION
Objetivos Alcance Referencias bibliográficas Factores Críticos Responsabilidades Datos de la muestra a ser utilizada (matriz) Analitos a ser ensayados Información del estándar Fechas Descripción de los parámetros a ser evaluados Equipos, materiales y reactivos Verificaciones Previas

28 VALIDACION DE MÉTODOS ANALÍTICOS - EVOLUCIÓN

29 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS - DEFINICIONES

30 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS CUANTITATIVOS
Los métodos cuantitativos de análisis exigen, para su validación, que se determine la siguiente serie de parámetros que han de cumplirse: Especificidad/selectividad Límite de detección Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio) Linealidad y rango de trabajo Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o reproducibilidad en laboratorio o Recuperación Incertidumbre de la medición

31 EXACTITUD Comparación con un método oficial, validado o estandarizado: La muestra debe ser analizada, utilizando el método a validar y un segundo método bien caracterizado, el cual debe tener una exactitud bien definida y establecida. Criterio de aceptación: Se lleva a cabo un análisis de varianza (ANOVA), del porcentaje de recuperación o del error relativo en porcentaje, para determinar si hay o no diferencia significativa entre la exactitud de los métodos comparados.

32 EXACTITUD Adición Estándar:
Con Placebo: Se utiliza una mezcla preparada en el laboratorio de todos los componentes de la matriz de la muestra sin el principio activo a determinar, luego el placebo se enriquece con estándar. Con Muestra: Cuando no es posible contar con un placebo, se determina por triplicado el contenido promedio del analito en la muestra con el método a validar; una vez conocido el contenido promedio se procede a enriquecer las muestras con estándar. Para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomada y se agregan cantidades variables del estándar.

33 exactitud Cuando se aplica a un método de ensayo, el termino “exactitud” se refiere a una combinación de veracidad y precisión.

34 EXACTITUD Los criterios de aceptación: Placebo enriquecido: 98% - 102%
Muestra enriquecida: Sobre 100 ppb (ng/L) 80%-100% de recuperación Menos de 100 ppb (ng/L ) 60%-110 % de recuperación Menos 1 ppb 70%-120% de recuperación

35 EXACTITUD Comparación de las curvas de regresión lineal de estándares con curvas de regresión lineal de placebos enriquecidos (métodos de curvas de respuesta relativa): Se preparan soluciones a diferentes niveles de concentración de placebo enriquecido ( 80, 100, 120%) y soluciones de estándares a los mismos niveles de concentración. Separadamente se evalúa la regresión lineal de ambos grupos y se lleva a cabo la comparación de las pendientes y los interceptos.

36 EXACTITUD Comparación de los resultados obtenidos de un estándar o material de referencia certificado: Se analiza por replicado el material, por el método a validar y se compara el resultado obtenido con el valor verdadero declarado, este método se encuentra limitado por la disponibilidad y la estabilidad del material de referencia, así como por el grado de incertidumbre que se tenga del valor verdadero de la concentración del material de referencia.

37 PRECISIÓN Existen diferentes maneras de determinar la precisión:
Repetibilidad Precisión Intermedia Reproducibilidad En términos generales la precisión, debe determinarse, analizando un número suficiente de alícuotas, que permitan calcular estadísticamente la desviación estándar y la desviación estándar relativa (%RSD).

38 REPETIBILIDAD Refiere al mismo analista, mismo equipo, mismos materiales en el mismo día Equipo o instrumento: evalúa el desempeño del sistema independientemente de la muestra a analizar. El método: evalúa el desempeño del método sobre las muestras analizadas en las mismas condiciones.

39 REPETIBILIDAD Criterio de aceptación: El método y el sistema propuestos cumplen con el ensayo de repetibilidad si cumplen con el valor de RSD. El valor de RSD depende de las concentraciones que se van a analizar. Ej.: si se va a determinar un analito cuya concentración es inferior a 10ppb el valor de RSD ≤ 20% Repetibilidad Area Concentracion 1 1,14 2 1,08 3 1,03 4 5 1,09 Media SD 88599,92 0,04 %RSD 3,7 3,6

40 REPRODUCIBILIDAD (Precisión intermedia)
Refiere a otro analista, en un equipo diferente, en un día diferente. (Entre laboratorios) Precisión Intermedia: se analizan las muestras de igual manera que en la repetibilidad pero con un analista diferente en un día diferente. Precisión intermedia Area Concentracion 1 1,13 2 1,14 3 1,09 4 1,08 5 1,07 Media SD 62608,81 0,03 %RSD 2,6 2,8

41 PRECISIÓN Al tener los datos de Repetibilidad y Reproducibilidad o Precisión Intermedia, se aplica un análisis de varianza “Prueba F de Fisher” Lo ideal es realizar con dos o más concentraciones dentro del rango establecido.

42 PRECISIÓN EJEMPLO

43 LINEALIDAD E INTERVALO (Sensibilidad)
El comportamiento lineal de un método, debe ser demostrado dentro del intervalo (rango) en el cual es probable que se trabaje. Este intervalo varía dependiendo del tipo de determinación a realizar. Por esta razón se establece los intervalos dentro de los cuales deben llevarse a cabo las pruebas para cada análisis. La determinación del intervalo o rango deriva del estudio de la linealidad

44 LINEALIDAD E INTERVALO DEL SISTEMA
Preparar en forma independiente soluciones de estándar al menos 5 niveles de concentración, las cuales deben encontrarse dentro de los intervalos establecidos para cada tipo de análisis. Este procedimiento debe repetirse en forma independiente por lo menos 3 veces, para evaluar estadísticamente la regresión lineal del sistema. Con éstos datos se grafica la respuesta de la medición, contra la concentración del analito. Se verifican datos con comportamiento atípico mediante mediciones adicionales. Realizar un análisis de varianza de la regresión lineal Calcular el coeficiente de regresión.

45 LINEALIDAD E INTERVALO DEL MÉTODO
Preparar soluciones de muestra o placebo enriquecidos a cinco niveles de concentración, los cuales deben encontrarse dentro de los intervalos establecidos. Este procedimiento debe repetirse en forma independiente por lo menos 3 veces, para evaluar estadísticamente la regresión lineal del método. Con estos datos se grafica la respuesta de la medición, contra la concentración del analito. Se verifican datos con comportamiento atípico mediante mediciones adicionales. Realizar un análisis de varianza de la regresión lineal. Calcular el coeficiente de regresión con la totalidad de los datos.

46 LINEALIDAD E INTEVALO CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:
El coeficiente de correlación de la regresión lineal debe encontrarse entre 0.98 y 1.00, el coeficiente de correlación al cuadrado debe ser mayor de 0.995 Se considera que la mejor manera de indicar la linealidad es por una prueba de t de Student. tr= r√(n-2) √(1-r2)

47 LINEALIDAD E INTEVALO CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
Distribución Normal de los residuos: H0: los datos siguen una distribución normal H1: los datos no siguen una distribución normal. Se acepta H0 si p-value (valor de p) es <0,05 P-value (valor de p): probabilidad de cometer un error del tipo 1

48 PRECISIÓN EJEMPLO

49 LIMITE DE DETECCIÓN Puede ser establecido de diferentes maneras dependiendo del tipo de método. Métodos no instrumentales: El límite de detección se determina por medio del análisis comparativo de un blanco y de muestras independientes de blanco enriquecido con diferentes niveles de concentraciones conocidas del analito. Se compara el comportamiento de las muestras con el blanco y se establece el nivel mínimo al cual el analito puede ser realmente detectado

50 Limite de detección Métodos Instrumentales:
Por comparación de blanco y blanco enriquecido a una sola concentración: Se utiliza cuando la desviación estándar del blanco es diferente de 0. Se preparan no menos de 10 blancos independientes y 10 blancos enriquecidos a la concentración más baja aceptada. Una vez preparadas las soluciones, se llevan a cabo las mediciones de cada una y posteriormente se calcula la desviación estándar de cada grupo de datos. Con estos datos se puede calcular el límite de detección LD= Valor promedio del blanco + 3S Donde S es la desviación estándar de la muestra enriquecida

51 Limite de detección Blanco enriquecido a una concentración: En este caso se analizan y cuantifican no menos de 10 soluciones de blanco enriquecidas o muestras enriquecidas preparadas a la concentración menor para la que se puede obtener un grado aceptable de incertidumbre. Se lleva a cabo la cuantificación para cada una de las soluciones, se calcula el valor promedio de las concentraciones obtenidas y la desviación estándar. LD= Concentración promedio obtenida para el blanco o la muestra enriquecida S

52 Limite de detección Método de comparación Señal / Ruido: En el caso de procedimientos analíticos instrumentales que están sujetos a ruido de fondo, los documentos de la International Conference Harmonization describen una aproximación común que consiste en comparar las señales de muestras con concentraciones bajas (conocidas) del analito, contra las señales del blanco. Se preparan muestras de concentración baja conocida a diferentes niveles de concentración, de acuerdo con el método en estudio. Se prepara un blanco, y se miden las señales de las soluciones preparadas. El Límite de detección corresponde a la concentración mínima a la cual el analito es detectado con una relación señal ruido de 2:1 o 3:1

53 Considerando un número suficiente de medidas de señal de fondo, se puede calcular que una señal es significativamente distinta del ruido, con 95% de probabilidad cuando su valor es 2 veces superior al intervalo de ruido. Cuando se incrementa la probabilidad hasta un 99% la señal debe ser al menos 2,65 veces superior al ruido para ser significativamente distinta.

54 EJEMPLO DE CALCULO DE LOD Y LOQ

55 ESPECIFICIDAD La especificidad puede verificarse de diferentes maneras, dependiendo del tipo de análisis a realizar. Es importante tomar en cuenta, que en aquellos casos en que la matriz de la muestra es variable, tanto en términos de su composición (productos biológicos o de origen natural), así como en la fuente de las materias primas que las componen (diferentes proveedores, diferentes orígenes), se recomienda que la especificidad se establezca para las diferentes composiciones o fuentes en forma independiente.

56 especificidad Comparación del comportamiento de la matriz o impurezas con respecto al comportamiento del estándar: [C]estándar = [C]Matriz (La matriz no debe presentar ningún tipo de señal que interfiera con la señal que se para el estándar.) Comparación del comportamiento de muestra con respecto al comportamiento del estándar: [C]estándar = [C]Muestra (La muestra no debe presentar ningún tipo de señal que interfiera con la señal que se encuentra para el estándar)

57 especificidad No siempre es posible demostrar que un procedimiento analítico es específico para un analito en particular (Combinación de dos o más procedimientos). Identificación: Materiales de Referencia Muestras que contengan el analito y placebos

58 Especificidad -impurezas
Impurezas Disponibles: Fortificados de las impurezas dentro de la muestra. Demostrar que los resultados del ensayo no sean afectados por la presencia de éstas. Impurezas no Disponibles: Degradación del producto bajo condiciones de estrés (luz, calor, humedad, ácido/base, hidrólisis y oxidación)

59 INCERTIDUMBRE “Parámetro positivo, asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que pudieran ser razonablemente atribuibles al mensurando, basada en la información usada”

60 incertidumbre La incertidumbre de las mediciones, por lo general, tiene muchos componentes. Se calcula estimando los errores que se producen en las distintas etapas del análisis, por ejemplo, la etapa preanalítica, la homogeneización, el pesaje, el pipeteado, la inyección, la extracción, la derivación, la recuperación y las curvas de calibración.

61 incertidumbre

62 incertidumbre Incertidumbre estándar (up): desviación estándar de la medición de la validación. Incertidumbre combinada (uc): combinación de las incertidumbres. Incertidumbre expandida (U): multiplicar la incertidumbre combinada por un factor de cobertura de k = 2, a fin de entregar un 95% de confianza, y así establecer el intervalo entorno al resultado de la medición.

63 incertidumbre EJEMPLO

64 ROBUSTEZ Ensayo de robustez: para estudiar el comportamiento de un procedimiento analítico cuando se hacen pequeños cambios en las condiciones ambientales y/o de operación. Involucra variaciones deliberadas en el método. Permite identificar aquellas variables que provocarán cambios significativos y que deberían ser controladas más estrictamente

65 robustez La evaluación de la robustez debe ser considerada durante la etapa de desarrollo del procedimiento analítico. Debe demostrar la confiabilidad de un análisis con respecto a variaciones deliberadas en los parámetros del método evaluado.

66 robustez Variaciones típicas Estabilidad de las soluciones
Tiempo de extracción En LC (pH y composición de la FM, columnas, Tº, flujo, etc) En GC (Columnas, temperatura, flujo,etc.)

67 robustez x-X < (√2)SD

68 robustez

69 robustez

70 resumen

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72

73 Validación-cromatografia
Ensayo: Cuantificación de Enalapril maleato en comprimidos Parámetros ensayados: Linealidad (r2>0,995), Precisión del sistema (%RSD<2%) y del método(%RSD<7%), Exactitud (90-110%).

74 Enalapril - linealidad
Rango: 150 a 250 µg/mL Niveles: 7 Pendiente: 19661 Intercepto: r2= 0,9992

75 Enalapril - exactitud Ensayos: 9 Niveles: 3 (40, 50 y 60 mg)
Placebo fortificado con cantidades conocidas de estándar de trabajo

76 Enalapril - especificidad
Se realizaron estudios de degradación acelerada en los comprimidos. Degradación hidrolítica y oxidativa: 3 muestras, 1 con HCl 0,1N, otra con NaOH 0,01N y otra con H2O2 al 1% y fueron analizadas. Luego a las mismas muestras se las trató con calor a baño María a 60ºC durante 2 horas. Degradación Térmica: se llevó las muestras a una temperatura de 80ºC durante 24 horas. Degradación Fotolítica: Se expuso las muestras bajo una lu (1900lux) durante 24 horas

77 Enalapril - especificidad
Se analizaron las muestras y se determinó la pureza del pico.(PDA; MS)

78 Enalapril – Adecuación del sistema
Se realizaron inyecciones de soluciones estándar y se determinaron el tailing y la eficiencia de la columna (HETP).

79 DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR METODO KJElDAHL

80 Se realizó una serie de 10 determinaciones, por diferentes analistas.
Validación determinación de proteinas en granos de soja por el método de hjeldahl Material de Referencia: Sulfato doble de hierro y amonio (sal de Mohr). (NH4)2Fe(II)(SO4)2*6H2O  7,145% de Nitrógeno. Se realizó una serie de 10 determinaciones, por diferentes analistas.

81 Tabla de resultados-1

82 Tabla de resultados-2

83 Recuperación (exactitud)
Experimental: se hicieron 10 repeticiones de la muestra del material de referencia con (7,145%N), trabajando con 0,5g de muestra. Resultados: X = 7,150%; S = 0,026 t calculada = 0,61 Recuperación = 100,07% t tabla = 2,26 P = 95% t calc < t tabla; los datos pertenecen a la misma población de valores como el valor de referencia Criterio de Aceptación: Recuperación = 80% - 120%; para concentraciones ≥ 10mg/kg

84 precisión Experimental: se hicieron 10 repeticiones de la muestra del material de referencia con (7,145%N), trabajando con 0,5g de muestra. Resultados: X = 7,150% S = 0,026 CV(RSD) = 0,36% Criterio de Aceptación: CV(RSD) ≤ 10%

85 repetibilidad Experimental: se hicieron 3 series de 10 repeticiones del material de referencia (7,145%N), hecho por un solo analista, en intervalos de tiempo cortos, usando el mismo equipo y el mismo método de trabajo. Cantidades de Trabajo: 0,3g – 0,5g – 0,7g

86 repetibilidad Resultados: Criterio de Aceptación: CV(RSD) ≤ 10%
Muestra 0,3g Muestra 0,5g Muestra 0,7g X 7,146 7,150 7,155 S 0,013 0,026 0,015 CV(RSD)% 0,182% 0,364% 0,210%

87 Reproducibilidad interna (precisión intermedia)
Experimental: se hicieron 3 series de 10 repeticiones del material de referencia (7,145%N), realizado por dos analistas, utilizando equipos, materiales de vidrio, y reactivos diferentes pero el mismo método. La cantidad de muestra utilizada fue de 0,5g para todas las series.

88 Reproducibilidad interna (precisión intermedia)
Resultados: Criterio de Aceptación: CV(RSD) ≤ 10% Analista I Analista II X 7,150 7,147 S 0,026 0,029 CV(RSD)% 0,364% 0,406%

89 Linealidad (sensibilidad)
Se hicieron 10 puntos a partir del material de referencia de 0,1g a 1,0g. Gramos de Muestra mgN 0,1 6,938 0,2 14,288 0,3 20,989 0,4 28,598 0,5 34,734 0,6 41,819 0,7 49,860 0,8 57,026 0,9 63,211 1,0 70,259

90 Linealidad (sensibilidad)
Resultados:

91 Linealidad (sensibilidad)
Prueba t de Student: Se desea probar si existe entonces una correlación significativa: La hipótesis nula H0 es que no existe correlación entre X e Y. Si el valor observado de tr es mayor que tcri, se rechaza la hipótesis nula H0, siendo la correlación lineal significativa con la probabilidad calculada. Tcri = 2.306 Tr = 141,39 Tr > Tcri Se observa que el valor observado de tr (es decir el t calculado) es mayor que tcrit (141,39 > 2,306), por lo cual se rechaza la hipotesis nula Ho, siendo la correlacion lineal significativa con la probabilidad calculada.

92 Linealidad (sensibilidad)
Criterio de Aceptación: El valor de la pendiente debe ser constante. a: debe tender a 0. R: el coeficiente de correlación debe tender a 1. Tr > Tcri

93 Limite de detección y limite de cuantificación
Experimental: Se hicieron 10 análisis del material de referencia, trabajando a 0,0013g para una concentración de 0,1mgN (Se trabaja sobre la mínima concentración en la que puede trabajar el equipo).

94 Limite de detección y limite de cuantificación
Resultados: X = 0,111 mgN S = 0,002 LOD = 3*0, ,111 = 0,117 mgN LOQ = 10*0, ,111 = 0,131 mgN Criterio de Aceptación: LOQ > LOD

95 MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN