Separación de células. Separación de células por centrifugación.

Presentación del tema: "Separación de células. Separación de células por centrifugación."— Transcripción de la presentación:

1 Separación de células

2 Separación de células por centrifugación

3 Separación de células Centrifugación isopícnica (en un gradiente de densidad)

4 Separación de células Formación de un gradiente discontinuo

5 Separación de células Formador de gradientes continuos

6 Separación de células Gradiente formado durante la centrifugación Gradiente de Percoll 20.000  g, 1 hora

7 Separación de células Centrifugación isopícnica Fibroblastos MR-5 Células HeLa

8 Separación de células Células HeLa Fibroblastos MR-5 Recuperación de las células

9 Separación de células Separación por elutriación

10 Separación de células La centrifugadora

11 Separación de células La cámara de separación

12 Separación de células A) Una población mixta de células entra en la cámara de separación con una velocidad de flujo y una velocidad de centrifugación determinadas B) Se aumenta la velocidad de flujo (o se reduce la velocidad de rotación) para que los distintos tipos de célula se vayan separando. Las células más pequeñas se colocan en el frente de elutriación. La separación por elutriación C) Se vuelve a aumentar la velocidad de flujo (o a reducir la velocidad de rotación) para que las células más pequeñas salgan de la cámara y se puedan recoger.

13 Separación de células Separación de células mediante campos magnéticos

14 Separación de células Dynabeads ® (Life technologies)

15 Separación de células Las Dynabeads ® se pueden conjugar con diversos ligandos

16 Separación de células La separación se realiza en tres pasos Paso nº 1 Paso nº 2 Paso nº 3

17 Separación de células El protocolo de separación puede constar de un solo paso o de varios. La selección puede ser positiva (se unen a las células que me interesan) o negativa (se unen a las que no me interesan). Hay protocolos que usan los dos tipos de selección. Separación de células con Dynabeads ®

18 Separación de células Dynabeads ® (Life technologies) Pincha en el recuadro para ver el vídeo

19 Separación de células MACS ® (Magnetic-activated cell sorting) Microbeads CD8 + T cells

20 Separación de células MACS ® microbeads (Miltenyi Biotec)

21 Separación de células Columnas Columnas MACS ®

22 Separación de células Las columnas MACS ® crean un campo magnético muy intenso

23 Separación de células La separación se realiza en tres pasos

24 Separación de células Separación con microesferas MACS ® (Miltenyi Biotec)

25 Separación de células Selección positiva

26 Separación de células Selección negativa

27 Separación de células

28 Citometría de flujo

29 Separación de células Citometría de flujo: Aplicaciones

30 Separación de células Componentes de un citómetro de flujo

31 Separación de células El punto de interrogación es el núcleo del sistema. Allí es donde el láser incide en la muestra y el sistema óptico recoge la luz difractada y la fluorescencia. El punto de interrogación

32 Separación de células Enfoque hidrodinámico En el punto de encuentro, el fluido envolvente arrastra a las células que van llegando por el conducto interno, que se hace más estrecho en su extremo Las células fluyen por un conducto central que está rodeado por otro conducto de mayor diámetro que transporta una disolución salina a mayor velocidad. El resultado final es que se crea una hilera de células que atravesarán el láser de una en una.

33 Separación de células Cuando el láser incide en la célula, ésta difracta la luz en todas direcciones La difracción frontal (o difracción de bajo ángulo) es la luz difractada hacia delante. Su intensidad es directamente proporcional al tamaño de la célula. Difracción a bajo ángulo

34 Separación de células Detección de la difracción a bajo ángulo La luz difractada se cuantifica mediante un detector que convierte la intensidad en voltaje Delante del detector hay una barra que evita que la intensa luz del láser incida directamente sobre él.

35 Separación de células La luz que llega al detector se convierte en un impulso de tensión La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula. Recogida de datos de difracción a bajo ángulo

36 Separación de células Recogida de datos de difracción a bajo ángulo La magnitud del impulso es proporcional al tamaño de la célula.

37 Separación de células Histograma de la difracción a bajo ángulo El histograma indica el número de células que presenta la propiedad física seleccionada o que expresa el marcador molecular de interés

38 Separación de células Umbral de detección de tamaños Si no se aplica un umbral, la señal mayoritaria corresponde a residuos celulares, bacterias o células pequeñas Aplicado un umbral, sólo se detectan las señales que superan un valor determinado

39 Separación de células La difracción lateral (o difracción de ángulo elevado) es la luz difractada hacia los lados. Difracción a ángulos elevados La difracción lateral es provocada por los gránulos y depende de la complejidad interna de la célula.

40 Separación de células Detección de la difracción a ángulos elevados La difracción lateral se mide en un detector colocado perpendicularmente (a 90º) a la trayectoria del láser.

41 Separación de células Histograma de la difracción a ángulo elevado

42 Separación de células La difracción frontal (en función del tamaño) parece indicar que sólo hay una población de células. La difracción lateral (en función de la complejidad) indica que hay tres tipos de células. Resultados combinados de la difracción

43 Separación de células Análisis bidimensional de la difracción Este histograma refleja dos parámetros. En el eje X se representa la difracción a bajo ángulo y en el eje Y la difracción a ángulos elevados. El número de células es proporcional a la densidad de puntos.

44 Separación de células Análisis multiparamétrico de la difracción

45 Separación de células Otro ejemplo

46 Separación de células El fenómeno de la fluorescencia

47 Separación de células Marcaje de células con anticuerpos fluorescentes Emission light

48 Separación de células Detección de la fluorescencia La fluorescencia se mide mediante detectores colocados perpendicularmente (a 90º) a la trayectoria del láser Mediante un sistema de filtros y espejos se dirige la señal de fluorescencia hasta los detectores (se pueden medir 3 ó 4 señales distintas en un mismo experimento)

49 Separación de células Cuando la célula marcada atraviesa el láser, se genera una señal de fluorescencia que llega al detector y se convierte en un pulso de tensión proporcional a la magnitud de la señal. Experimento con fluorescencia (1 color)

50 Separación de células Histograma de la fluorescencia (1 color)

51 Separación de células Experimento con fluorescencia (2 colores) La excitación de los dos fluoróforos se lleva a cabo con láser de una longitud de onda de 480 nm

52 Separación de células Longitudes de onda de excitación y emisión Cada fluoróforo emite fluorescencia con una longitud de onda distinta: Alexa emite a 520 nm y la Ficoeritrina emite a 580 nm

53 Separación de células Cuatro poblaciones de células

54 Separación de células FACS (Fluorescence-activated cell sorter)

55 Separación de células La gota que contiene una célula se aproxima al punto de interrogación La gota se carga según el tipo de fluorescencia que tenga la célula. La carga (positiva, negativa o nula) determina hacia qué tubo se dirige la célula. Cómo se clasifican las células

56 Separación de células Clasificación de células del sistema inmunitario

57 Separación de células Clasificación de las células La gota que contiene una célula se aproxima al punto de interrogación La gota se carga según el tipo de fluorescencia que tenga la célula. La carga (positiva, negativa o nula) determina a qué tubo se dirige la célula.

58 Separación de células La vibración de la boquilla hace que se formen gotas

59 Separación de células 1.- Cada célula es analizada por el láser 3.- La continua vibración de la boquilla por donde sale la muestra interrumpe el flujo continuo del líquido y genera gotas. En una gota puede haber una célula o ninguna. 2.- A cada célula se le asigna un tipo de carga, en función de la fluorescencia que contiene (positiva, negativa o nula). 4.- A medida que van cayendo, las placas deflectoras atraen o repelen las gotas, que son recogidas en distintos tubos según su carga (positiva, negativa o nula). 5.- Las células recogidas se vuelven a analizar para comprobar que en cada tubo hay un único tipo de células. 6.- Las células recogidas se pueden cultivar para obtener un mayor número de ellas. Funcionamiento del FACS