CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS

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1 CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS
MONO Y DISACÁRIDOS SOLUBILIDAD: MUY SOLUBLES EN AGUA MENOS SOLUBLES EN ETANOL ALGO SOLUBLES EN ETANOL CON AGUA CALIENTE INSOLUBLES EN SOLVENTES ORGÁNICOS (EXCEPTO PIRIDINA)

2 IMPORTANCIA DE LA SOLUBILIDAD DE LOS CARBOHIDRATOS
INFLUYE EN LA HABILIDAD PARA REALIZAR DETERMINACIONES DE DENSIDAD. EXISTE RELACIÓN ENTRE SU DENSIDAD Y SU CONCENTRACIÓN

3 ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS
MUY ÚTIL PARA DETERMINAR SU CONCENTRACIÓN. EXACTO SÓLO PARA SOLUCIONES DE PURA SACAROSA. AMPLIAMENTE USADO PARA APROXIMAR VALORES PARA OTRAS SOLUCIONES AZUCARADAS.

4 ROTACIÓN ÓPTICA DE LOS CARBOHIDRATOS
FACILITA AL MÉTODO PARA MEDIR LA CONCENTRACIÓN DEL AZÚCAR EN SOLUCIÓN. MÉTODO BASADO EN MEDICIONES POLARIMÉTRICAS. GENERALMENTE UTILIZADO CON SACAROSA Y ALMIDÓN.

5 PROPIEDADES REDUCTORAS DEL GRUPO CETO O ALDEHÍDO
EL GRUPO CETO O ALDEHÍDO REDUCIRÁN SOLUCIONES ALKALINAS DE SALES METÁLICAS AL METAL ÓXIDO O LIBRE. LA REACCIÓN ENTRE EL AZÚCAR Y EL SULFATO CÚPRICO NO ES ESTEQUIOMÉTRICA Y PROPORCIONA ÓXIDO CUPROSO MUY DEPENDIENTE DE LAS CONDICIONES DE LA REACCIÓN.

6 REACCIONES DE CONDENSACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS
MONOSACÁRIDOS + ÁCIDO FUERTE + CALOR → SUBSTANCIAS QUE SE CONDENSAN CON REACTIVOS (E.G. FENOL) PARA PROPORCIONAR COMPLEJOS COLOREADOS. PÉRDIDA DE AGUA Y FORMACIÓN DE DERIVADOS DEL FURFURAL. (SE DEBE CONTROLAR LA FUERZA DEL ÁCIDO, EL TIEMPO Y LA VELOCIDAD DE CALENTAMIENTO)

7 REACCIONES DE SUSTITUCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS
FORMACIÓN DE ÉTER (E.G. METIL ÉTERES) ESTERIFICACIÓN (E.G. ACETATOS DE ALDITOL) IMPORTANTES EN LA PREPARACIÓN DE DERIVADOS VOLÁTILES PARA LA CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO.

8 PROPIEDADES DE LOS POLISACÁRIDOS
SOLUBILIDAD.- VARÍA ENORMEMENTE DEXTRINAS (ALMIDONES DE VARIAS COMPOSICIONES PARCIALMENTE HIDROLIZADOS) AMILOPECTINA Y GLUCÓGENO.- SE DISPERSAN PARCIALMENTE EN AGUA CALIENTE.

9 SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS
SUBSTANCIAS PÉCTICAS.- SOLUBLES EN AGUA CALIENTE A MENOS QUE CONSTITUYAN UN COMPLEJO CON Ca. GOMAS, MUCÍLAGOS, ARABINOXILANOS, ß-GLUCANOS.- SOLUBLES EN AGUA

10 SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS
CELULOSA, ALGUNOS MANANOS Y XILANOS, HEMICELULOSA.- INSOLUBLES EN AGUA. EN GENERAL LOS POLISACÁRIDOS SON INSOLUBLES EN ALCOHOLES ACUOSOS CON FUERZAS POR ARRIBA DE 75 A 80% (v/v).

11 FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE LOS POLISACÁRIDOS
EL ALMIDÓN FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON EL YODO EN SOLUCIÓN DE NaCl/KI. LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS DE LAS ALGAS DE TIPO CARRAGENO FORMAN COMPLEJOS CON LOS COMPUESTOS CUATERNARIOS DE AMONIO

12 HIDRÓLISIS DE LOS POLISACÁRIDOS
LA MAYORÍA DE LOS POLISACÁRIDOS SON SUJETOS A LA HIDRÓLISIS EN PRESENCIA DE ÁCIDOS DILUIDOS. LA MAYORÍA DE LOS COMPONENTES DE LA HIDRÓLISIS SON ESTABLES EN LOS ÁCIDOS DILUIDOS (EXCEPTO LA FRUCTOSA Y TAL VEZ LA ARABINOSA)

13 SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS
LA CELULOSA ES MUY ESTABLE A LA HIDRÓLISIS ÁCIDA (SE NECESITAN 72% (p/p) DE H2SO4 PARA DEGRADARLA) LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO DE UN POLISACÁRIDO CONFIEREN ESTABILIDAD EN EL ENLACE GLUCOSÍDICO ADYACENTE.

14 SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS
LA MAYORÍA DE LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO SE LIBERAN EN COMBINACIÓN CON OTRO RESIDUO, PRODUCIENDO UN DISACÁRIDO EXTREMADAMENTE RESISTENTE A LA HIDRÓLISIS ÁCIDA.

15 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES LIBRES
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA CUANDO LOS AZÚCARES ESTÁN EN SOLUCIÓN GASES DISUELTOS.- REMUÉVANSE DE LOS PRODUCTOS CARBONATADOS O FERMENTADOS MEDIANTE VACÍO

16 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
PIGMENTOS.- PUEDEN INTERFERIR CON LAS REACCIONES. EXISTEN MUCHAS MANERAS DE ELIMINARLOS (E.G. CARBÓN O SALES DE PLOMO) ACETATO DE PLOMO BÁSICO.- INTERFERIRÁ CON LOS MÉTODOS POLARIMÉTRICOS.

17 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
ACETATO DE PLOMO NEUTRO.- FORMA PREFERENTE DE USO. SE UTILIZA COMO UNA SOLUCIÓN ACUOSA SATURADA. SE ELIMINA EL EXCESO AÑADIENDO YA SEA OXALATO DE SODIO O POTASIO.

18 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
DESPROTEINIZACIÓN LAS PROTEÍNAS INTERFIEREN CON LAS DETERMINACIONES REDUCTORAS Y COLORIMÉTRICAS. EL USO DE TCA (ÁCIDO TRICLOROACÉTICO) ES DEMASIADO FUERTE PARA DESPROTEINIZAR SI LA MUESTRA EN SOLUCIÓN CONTIENE DISACÁRIDOS O FRUCTOSA.

19 DESPROTEINIZACIÓN DE LA MUESTRA
MÉTODOS ACEPTABLES: AÑÁDASE ETANOL O ACETONA AL 70% (v/v). LA MAYORÍA DE LAS PROTEÍNAS COAGULARÁN Y SE PODRÁN FILTRAR O CENTRIFUGAR.

20 DESPROTEINIZACIÓN DE LA MUESTRA
b) PRECIPITACIÓN CON METALES PESADOS BAJO CONDICIONES ALKALINAS. EJEMPLO: LA SOLUCIÓN CARREZ PRECIPITA PROTEÍNAS, ABSORBE ALGUNOS COLORES, Y ROMPE EMULSIONES.

21 PROCEDIMIENTO SE AÑADE A LA MUESTRA LÍQUIDA SOLUCIÓN CARREZ I (HEXACIANOFERRATO DE POTASIO, K4[Fe(CN)6]·3H2O), SE AÑADE A LA MUESTRA SOLUCIÓN CARREZ II (SULFATO DE ZINC (ZnSO4·7 H2O), Y SOLUCIÓN DE NaOH. SE ENFRÍA, SE DILUYE A UN VOLUMEN DETERMINADO Y SE FILTRA.

22 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN DE AZÚCAR
SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UN EXTRACTOR SOXHLET SE AÑADE LA MUESTRA AL ETANOL AL 80% (v/v, CONCENTRACIÓN FINAL) HIRVIENDO. LOS POLISACÁRIDOS SON INSOLUBLES Y EL CALOR INACTIVA A LAS ENZIMAS.

23 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN DE AZÚCAR
PUEDE AÑADIRSE CARBONATO DE CALCIO PARA NEUTRALIZAR LOS ÁCIDOS DEL ALIMENTO, YA QUE ÉSTOS PUEDEN OCASIONAR LA HIDRÓLISIS DE LOS POLISACÁRIDOS. TAMBIÉN SE DEBE USAR EXTRACTANTE DE ALCOHOL EN BUFFER PARA EVITAR LA HIDRÓLISIS ÁCIDA

24 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN DE AZÚCAR
EN CASO DE QUE SE NECESITE ELIMINAR EL ETANOL DEL EXTRACTO PREVIO AL ANÁLISIS SE PUEDE REALIZAR ESTE PASO MEDIANTE VACÍO. TAMBIÉN SE PUEDE REALIZAR CALENTANDO LEVEMENTE EN BAÑO MARÍA BAJO CAMPANA DE EXTRACCIÓN O MEDIANTE UN ROTAVAPOR.

25 MÉTODOS DE ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS
MÉTODOS QUÍMICOS MÉTODO FLUORIMÉTRICO MÉTODOS ENZIMÁTICOS CROMATOGRAFÍA DE GASES CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA MÉTODOS FÍSICOS

26 MÉTODOS QUÍMICOS REACCIONES DEL H2SO4 Y CARBOHIDRATOS
ÁCIDO FENOL SULFÚRICO FUNDAMENTO.- PROVIENE DE LOS PRODUCTOS DE REACCIÓN Y DEGRADACIÓN DEL ÁCIDO Y EL AZÚCAR.

27 ÁCIDO FENOL SULFÚRICO EL AZÚCAR SE TORNA PRINCIPALMENTE HIDROXIMETILFURFURAL (HMF) O FURFURAL (F) LOS CUALES SON REALMENTE DETERMINADOS LEYENDO LA ABSORBANCIA A 490nm H2SO4 CONC. FENOL + CARBOHIDRATO → AMARILLO – NARANJA CALOR

28 ÁCIDO FENOL SULFÚRICO H+ H+ POLISACÁRIDOS → MONOSACÁRIDOS → F + HMF
∆ ∆

29 VENTAJAS DEL MÉTODO ES SENCILLO ES RÁPIDO
SENSIBLE A MUY BAJOS NIVELES DE AZÚCAR (E.G. 5μg) ESPECÍFICO PARA CARBOHIDRATOS. NO EXISTE INTERFERENCIA CON PROTEÍNAS

30 VENTAJAS DEL MÉTODO A MENUDO NO ES NECESARIA LA CLARIFICACIÓN DE LA MUESTRA LOS REACTIVOS SON BARATOS Y ESTABLES COLOR ESTABLE RESULTADOS REPRODUCIBLES RESULTADOS CONFIABLES

31 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
LOS CARBOHIDRATOS QUE NO PROPORCIONAN HMF Y F EN LA DESCOMPOSICIÓN ÁCIDA RESULTAN EN UNA AMPLIA GAMA DE COLORES. POR TANTO EL MÉTODO NO MIDE TODOS LOS CARBOHIDRATOS

32 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
MIDE LA MAYORÍA DE LOS CARBOHIDRATOS PERO LA INTENSIDAD DEL COLOR VARÍA AMPLIAMENTE ENTRE LOS CARBOHIDRATOS, POR LO QUE SE DEBE SELECCIONAR UNO DE ELLOS COMO REFERENCIA

33 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
LA PROPORCIÓN DE H2SO4 ES MUY IMPORTANTE YA QUE SE ADICIONA H2SO4 COMO FUENTE DE CALOR A LA MUESTRA ACUOSA. SE DEBE EVITAR LA CONTAMINACIÓN PROVENIENTE DEL PAPEL FILTRO O POLVO DE CELULOSA

34 ANTRONA – ÁCIDO SULFÚRICO (9,10 DIHIDRO-9-OXOANTRACENO)
FUNDAMENTO EL MÉTODO ES BÁSICAMENTE IGUAL AL DEL FENOL PERO EL COLOR QUE SE OBTIENE ES AZÚL – VERDE Y SE LEE A UNA ABSORBANCIA DE 620nm. TIENE LAS MISMAS VENTAJAS Y DESVENTAJAS QUE EL MÉTODO ANTERIOR.

35 DETERMINACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES
AZÚCAR + ÁLKALI → FRAGMENTOS DE AZÚCAR REDUCTOR + Cu(OH)2 ← COMPLEJO DE COBRE DE TARTRATO Y CITRATO ↓ ∆ OH H2O + Cu2O ---- CuOH ---- Cu+ + MEZCLA DE ÁCIDOS DE AZÚCAR

36 SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO DOS SOLUCIONES :
SOLUCIÓN A: SULFATO DE COBRE CRISTALINO SOLUCIÓN B: TARTRATO DE SODIO Y POTASIO (O CITRATO DE SODIO) + HIDRÓXIDO DE SODIO (O HIDRÓXIDO DE POTASIO O CARBONATO DE SODIO)

37 SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO
EL CITRATO O TARTRATO EVITA LA PRECIPITACIÓN DEL HIDRÓXIDO CÚPRICO EL ÁLKALI ENOLIZA A LOS AZÚCARES Y PROVOCA SU ROMPIMIENTO EN FRAGMENTOS REACTIVOS QUE PUEDEN OXIDARSE INMEDIATAMENTE: Cu++ (CÚPRICO) ES REDUCIDO A Cu+ (EL IÓN CUPROSO)

38 SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO
A MEDIDA QUE LOS IONES Cu++ SE REDUCEN POR LOS FRAGMENTOS DE AZÚCAR, LOS IONES Cu+ SE COMBINAN CON LOS IONES HIDROXILO PARA FORMAR HIDRÓXIDO DE COBRE (DE COLOR AMARILLO, Cu+).

39 SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO
EL CuOH REDUCIDO PIERDE H2O EN PRESENCIA DE CALOR PARA DAR COMO RESULTADO ÓXIDO CUPROSO INSOLUBLE (Cu2O)

40 SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO
LA DETERMINACIÓN DEL COBRE REDUCIDO SE PUEDE LLEVAR A CABO POR GRAVIMETRÍA, VOLUMETRÍA, O POR MÉTODOS ELECTROLÍTICOS. EL PESO DEL Cu2O SÓLO ES APLICABLE A MUESTRAS RELATIVAMENTE PURAS.

41 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FEHLING
LA REDUCCIÓN DEL COBRE Y LA OXIDACIÓN DE LOS AZÚCARES NO ES ESTEQUIOMÉTRICA . LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO CUPROSO VARÍA, DEPENDIENDO DEL REACTIVO ÁLKALI, LA VELOCIDAD Y TIEMPO DE CALENTAMIENTO Y LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES EN LA MUESTRA

42 DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FEHLING
LOS AZÚCARES DIFIEREN EN SU HABILIDAD PARA REDUCIR LA SOLUCIÓN CÚPRICA, POR TANTO, LA TITULACIÓN (O PESO O ABSORBANCIA) DEBEN SER CONVERTIDOS EN (mg DE COBRE) Y POSTERIORMENTE SE RECURRIRÁ A TABLAS PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR PRESENTE EN LA MUESTRA

43 MÉTODO DE MUNSON WALKER
FUNDAMENTO NaOH + Cu++ + AZÚCAR REDUCTOR → Cu+ + AZÚCAR ∆ (Cu2O) OXIDADO LA DETERMINACIÓN DEL Cu2O PUEDE SER GRAVIMÉTRICA, PERO ES GENERALMENTE MEJOR TITULAR EL ÓXIDO CUPROSO. ESTO SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UNO DE LOS SIGUIENTES MÉTODOS (SE LLEVAN MUCHO TIEMPO):

44 TITULACIÓN DEL PERMANGANATO DE POTASIO
EL Cu2O REACCIONA CON EL IÓN FÉRRICO (Fe+++) EL CUAL ES REDUCIDO AL IÓN FERROSO (Fe++). POSTERIORMENTE EL IÓN FERROSO ES TITULADO (+2 →+3) CON PERMANGANATO (+3, ROSA → +2, INCOLORO) 1) Cu2O + Fe2(SO4)3 → 2FeSO4 + CuSO4 + CuO

45 TITULACIÓN DEL PERMANGANATO DE POTASIO
2) 10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

46 TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO
SE OXIDA EL Cu+ A Cu++ CON ÁCIDO NÍTRICO. POSTERIORMENTE SE HIERVE LA MUESTRA PARA ELIMINAR EL EXCESO DE HNO3 HNO3 Cu2O → Cu(NO3)2 ∆

47 TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO
SE AÑADE UNA CANTIDAD CONOCIDA DE SOLUCIÓN DE KI 2I- + 2Cu++ → 2Cu+ + I2

48 TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO
SE TITULA EL I2 LIBERADO CON UNA SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3) S2O3-2 I2 + I- → I3- → S4O I- (TRIIODURO) SE USA ALMIDÓN COMO INDICADOR: AZÚL → INCOLORO

49 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE LOS DIFERENTES AZÚCARES REDUCTORES. SE REQUIEREN MUESTRAS RELATIVAMENTE GRANDES (100 A 200mg DE GLUCOSA POR DETERMINACIÓN.

50 MÉTODO SOMOGY I-NELSON
AZÚCAR REDUCTOR + Cu++ → Cu+ + AZÚCAR REDUCTOR

51 MÉTODO SOMOGY I-NELSON
PROCEDIMIENTO: Reactivo de Somogyi Cu+2 Muestra (Azúcar reductor +) Calor Azúcar Oxidante + Cu+ (Cu2O) Cu+1red) Cu+2(oxi) AsMo (ox) AsMo (red) Es de un fuerte color azul Se lee la absorbancia a 500 nm. Se cuantifica con la curva estándar

52 Reactivos para el Método de Somogy i y Nelson para azúcares reductores
Reactivo de Somogy i NaCO3 - Carbonato de sodio NaHCO3 – Bicarbonato de Sodio KaNaC4H4O6 – Tartrato de Sodio Potasio CuSO4·5H2O –Sulfato de Cobre Reactivo de Nelson (NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonio Na2HAsO7·H2O – Arsenato de Sodio H2SO4 – Ácido Sulfúrico

53 MÉTODO FLUORIMÉTRICO FUNDAMENTO
ESTE MÉTODO ES POSIBLE CUANDO LOS COMPUESTOS ABSORBEN RADIACIÓN A LONGITUD DE ONDA CORTA Y LUEGO EMITEN RADIACIÓN A UNA LONGITUD DE ONDA MÁS LARGA.

54 DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR EL MÉTODO FLUORIMÉTRICO
EXTRACCIÓN CON ISO-BUTIL METIL CETONA. REACCIÓN CON HIDRACIDA DE ÁCIDO p-HIDROXIBENZOICO ADICIÓN DE REACTIVO Y LECTURA A UNA EMISIÓN DE 470nm EXCITACIÓN A 454nm

55 MÉTODOS ENZIMÁTICOS INFORMACIÓN GENERAL
REQUIEREN DE UN EXTRACTO NEUTRO O ÁCIDO LIBRE DE ALCOHOLES Y METALES PESADOS (NO SE PUEDEN USAR SALES DE PLOMO PARA CLARIFICAR LOS EXTRACTOS)

56 APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS ENZIMÁTICOS
SON POSIBLES PARA UN GRAN NÚMERO DE CARBOHIDRATOS O COMPUESTOS RELACIONADOS: MONOSACÁRIDOS DISACÁRIDOS POLISACÁRIDOS ALOCHOLES Y POLIOLES ÁCIDOS

57 FUNDAMENTO GLUCOSA EXISTEN KITS QUE CONTIENEN LOS SIGUIENTES REACTIVOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA: BUFFER, o – DIANISIDINA · 2HCl (CROMÓGENO REDUCIDO) CATALASA GLUCOSA OXIDASA

58 REACCIONES GLUCOSA OXIDASA H2O + O2 + GLUCOSA → LACTONA DE ÁCIDO D-GLUCÓNICO + H2O CATALASA H2O2 → H2O + ½ O2 O2 + CROMÓGENO INCOLORO, REDUCIDO → CROMÓGENO AZÚL OXIDADO

59 DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE SACAROSA/GLUCOSA
LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA ES DETERMINADA ANTES Y DESPUÉS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

60 DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA ANTES DE LA INVERSIÓN
A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA FOSFORILACIÓN DE GLUCOSA MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO. EN PRESENCIA DE GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH) LA GLUCOSA-FOSFATO PRODUCIDA ES ESPECÍFICAMENTE OXIDADA POR EL NADP A GLUCONATO-FOSFATO CON LA FORMACIÓN DE NADP REDUCIDO.

61 REACCIONES HK GLUCOSA + ATP → G6P + ADP G6P-DH G6P + NADP+ → GLUCONATO-FOSFATO + NADPH + H+ EL NADPH FORMADO EN ESTA REACCIÓN ES ESTEQUIOMÉTRICO CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE MIDE MEDIANTE EL AUMENTO EN ABOSROBANCIA A 334, 340 Ó 365 nm.

62 INVERSIÓN ENZIMÁTICA. A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES HIDROLIZADA POR LA ENZIMA ß-FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A GLUCOSA Y FRUCTOSA: ß-FRUCTOSIDASA SACAROSA + H2O → GLUCOSA + FRUCTOSA EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO DE LA DIFERENCIA DE CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ANTES Y DESPUÉS DE LA INVERSIÓN ENZIMÁTICA

63 CROMATOGRAFÍA DE GASES
FUNDAMENTO LOS AZÚCARES SON COMPUESTOS POLIHIDROXI UNIDOS FUERTEMENTE POR HIDRÓGENO YA SEA A AGUA O A ELLOS MISMOS EN CRISTALES. POR TANTO, TIENEN PUNTOS DE FUSIÓN MUY ALTOS ( °C)

64 CROMATOGRAFÍA DE GASES FUNDAMENTO
LOS AZÚCARES SE PUEDEN CONVERTIR EN DERIVADOS VOLÁTILES POR MÉTODOS DE UN PASO ANTES DE SER SUJETOS A ANÁLISIS POR CG. LOS MÁS CONVENIENTES PARECEN SER: ACETATOS DE ALDITOL, METIL ÉTERES, Y TRIMETISILIL ÉTERES.

65 CROMATOGRAFÍA DE GASES FUNDAMENTO
LA ALTA TEMPERATURA PUEDE OCASIONAR LA DEGRADACIÓN TÉRMICA DE LOS AZÚCARES, PARTICULARMENTE LA PÉRDIDA DE AGUA PARA FORMAR DERIVADOS ANHIDRO. LOS TRIMEISILIL ÉTERES TIENEN LA VENTAJA DE LA COMBINACIÓN DE ESTABILIDAD Y VOLATILIDAD QUE PERMITEN LA DETERMINACIÓN POR CG DE OLIGOSACÁRIDOS DE HASTA 7 CARBONOS

66 CROMATOGRAFÍA DE GASES PROCEDIMIENTO
SE PREPARAN DERIVADOS VOLÁTILES DE CARBOHIDRATOS SE INYECTAN EN LA COLUMNA CALIENTE DEL CG LOS DERIVADOS VOLÁTILES PASAN A DIFERENTES VELOCIDADES A TRAVÉS DE LA COLUMNA CON UNA CORRIENTE LEVE DE GAS ACARREADOR

67 CROMATOGRAFÍA DE GASES PROCEDIMIENTO
LOS COMPONENTES SEPARADOS ALCANZAN EL FINAL DE LA COLUMNA Y EL DETECTOR. LA SEÑAL GENERADA POR EL DETECTOR CONDUCE A LA PLUMILLA DE LA CARTA REGISTRADORA A OBTENER UN PICO PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE LA SUBSTANCIA.

68 MÉTODOS FÍSICOS DENSIMETRÍA
FUNDAMENTO LA GRAVEDAD ESPECÍFICA DE UNA SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO A UNA TEMPERATURA DEFINIDA. LA PRESENCIA DE OTROS MATERIALES SOLUBLES AFECTA LA GRAVEDAD ESPECÍFICA DE LA SOLUCIÓN, PERO ESTE MÉTODO PROPORCIONA UNA APROXIMACIÓN A LA CANTIDAD DE AZÚCAR PRESENTE EN SOLUCIONES DE AZÚCAR RELATIVAMENTE PURA

69 DETERMINACIÓN POR DENSITOMETRÍA
EL INSTRUMENTO DE MEDICIÓN ES UN HIGRÓMETRO (TAMBIÉN UTILIZADO PARA MEDIR SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES). SE HA DISEÑADO UN HIGRÓMETRO ESPECIAL PARA LEER EL % DE AZÚCAR DIRECTAMENTE A 20°C (GRADOS BRIX).

70 ÍNDICE DE REFRACCIÓN FUNDAMENTO
EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA MEDIDA DE SU CONCENTRACIÓN. LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES AZÚCARES DE IGUAL CONCENTRACIÓN TIENEN APROXIMADAMENTE EL MISMO ÍNDICE DE REFRACCIÓN

71 ÍNDICE DE REFRACCIÓN PROCEDIMIENTO
SE DETERMINA EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LA SOLUCIÓN AZUCARADA A 20°C MEDIANTE UN REFRACTÓMETRO ABBÉ O UN REFRACTÓMETRO MANUAL. SE OBTIENE POR LECTURA DIRECTA EL % DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES (COMO SACAROSA) DE UNA TABLA DE ÍNDICES DE REFRACCIÓN A % DE SACAROSA COMO FACTORES DE CORRECCIÓN.

72 POLARIMETRÍA FUNDAMENTO
LA RADIACIÓN SE COMPORTA COMO SI TUVIERA UN COMPONENTE ELÉCTRICO Y UNO MAGNÉTICO. ACTÚAN COMO SI ESTUVIERAN DISPUESTOS EN ÁNGULOS RECTOS UNO CON RESPECTO AL OTRO. HAY MILLONES DE RAYOS QUE PROVIENEN DE LA FUENTE LUMINOSA. LA DIRECCIÓN DE LOS COMPONENTES ELÉCTRICOS Y MAGNÉTICOS ES PURAMENTE ALEATORIA, ASÍ QUE SE TIENE RADIACIÓN NO POLARIZADA.

73 POLARIMETRÍA FUNDAMENTO
SI SE PUEDE HACER QUE TODOS LOS RAYOS TENGAN ORIENTADOS SUS COMPONENTES ELÉCTRICOS Y MAGNÉTICOS EN LA MISMA DIRECCIÓN, LA RADIACIÓN SERÁ POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE PUEDE LOGRAR MEDIANTE EL USO DE UN FILTRO POLARIZADOR.

74 POLARIMETRÍA FUNDAMENTO
CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA EN UNA MOLÉCULA ASIMÉTRICA (UN COMPUESTO QUE NO PUEDE PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO). LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES LLAMADO “COMPUESTO ÓPTICAMENTE ACTIVO” (e.g. GLUCOSA). SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRÍA LA LUZ POLARIZADA NO SERÁ AFECTADA.

75 POLARIMETRÍA FUNDAMENTO
EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO MANUALMENTE PARA COMPAGINAR VISUALMENTE LOS MATICES DE UN COLOR. ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ POLARIZADA DE REGRESO A SU POSICIÓN ORIGINAL. SE MIDE EL GRADO DE ROTACIÓN REQUERIDO.

76 MAGNITUD DE LA ROTACIÓN
DEPENDIENTE DE: LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ UTILIZADA. LONGITUD DE LA CELDA NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA ACTIVA Y SU CONCENTRACIÓN TEMPERATURA

77 POLARÍMETROS vs SACARÍMETROS
POLARÍMETRO: USA LUZ MONOCROMÁTICA Y LEE EN GRADOS ANGULARES (SE DEBE RELACIONAR CON LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR). SACARÍMETRO: USA LUZ BLANCA Y LEE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR DIRECTA.

78 SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS MÉTODOS
SE UTILIZAN ESTOS MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS O INGREDIENTES DE LOS MISMOS. PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA DE UN ALIMENTO PARA POSTERIOR ESTUDIO EN EL LABORATORIO.

79 SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS FUNDAMENTO GENERAL
LOS MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EXPLOTAN LAS DIFERENCIAS BIOQUÍMICAS EN LA SOLUBILIDAD DE LAS MISMAS, SU TAMAÑO, CARGA, CARACTERÍSTICAS DE ADSORCIÓN, AFINIDAD BIOLÓGICA POR OTRAS MOLÉCULAS. LAS TÉCNICAS SE UTILIZAN PARA PURIFICAR PROTEÍNAS INDIVIDUALES A PARTIR DE MEZCLAS COMPLEJAS.

80 CONSIDERACIONES GENERALES
ANTES DE EMPEZAR UNA SECUENCIA DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS PARA SU PURIFICACIÓN SE DEBE CONOCER: SU PESO MOLECULAR, SU PUNTO ISOELÉCTRICO, SUS PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD, SU TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIÓN, ALGUNA CARACTERÍSTICA QUE LA DISTINGA DE LAS DEMÁS PROTEÍNAS.

81 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
LOS MÁS COMÚNES SON: PRECIPITACIÓN CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN DE TAMAÑO

82 SEPARACIÓN POR CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD DIFERENCIAL
FUNDAMENTO LA SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN EXPLOTA LAS DIVERSAS DIFERENCIAS EN SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN. LAS PROTEÍNAS SON POLIELECTROLITOS Y SUS CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD ESTÁN DETERMINADAS POR EL TIPO Y CARGA DE AMINO ÁCIDOS EN LA MOLÉCULA.

83 PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL DE LAS PROTEÍNAS
CAMBIANDO EL pH DEL BUFFER FUERZA IÓNICA CONSTANTE DIELÉCTRICA TEMPERATURA

84 PROCEDIMIENTOS SALADO (SALTING OUT)
LAS PROTEÍNAS TIENEN PERFILES DE SOLUBILIDAD ÚNICOS EN SOLUCIONES DE SAL NEUTRAS. LAS BAJAS CONCENTRACIONES DE SALES NEUTRAS AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.

85 SALADO (SALTING OUT) FUNDAMENTO
SI SE AUMENTA LA FUERZA IÓNICA DE LA SOLUCIÓN LAS PROTEÍNAS SE PRECIPITAN. ESTE ES UNO DE LOS PRIMEROS PASOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS. ÉSTAS SE PUEDEN SEPARAR DE UNA MEZCLA MUY COMPLEJA CON ESTE MÉTODO.

86 SALADO (SALTING OUT) REACTIVOS
SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4]. SE USA COMÚNMENTE DEBIDO A QUE ES ALTAMENTE SOLUBLE. TAMBIÉN SE PUEDEN USAR: NaCl, O KCl.

87 PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA FUNDAMENTO
PUNTO ISOELÉCTRICO (pI). DEFINIDO COMO EL pH AL QUE UNA PROTEÍNA NO TIENE CARGA NETA EN SOLUCIÓN. LAS PROTEÍNAS SE AGREGAN Y PRECIPITAN EN SU pI DEBIDO A QUE NO EXISTE REPULSIÓN ELECTROSTÁTICA ENTRE MOLÉCULAS.

88 PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA FUNDAMENTO
LAS PROTEÍNAS TIENEN DIFERENTES pI’S, POR TANTO, PUEDEN SER SEPARADAS AJUSTANDO EL pH DE LA SOLUCIÓN. CUANDO SE AJUSTA EL pH DE UNA SOLUCIÓN AL pI DE UNA PROTEÍNA ÉSTA PRECIPITA. SI LAS DEMÁS PROTEÍNAS TIENEN OTROS pI’S ÉSTAS PERMANECERÁN EN SOLUCIÓN

89 PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR TAMAÑO
FUNDAMENTO LOS PESOS MOLECULARES DE LAS PROTEÍNAS SON DE A MÁS DE POR TANTO, EL TAMAÑO ES UN PARÁMETRO A EXPLOTAR PARA SU SEPARACIÓN. LA SEPARACIÓN REAL OCURRE BASADA EN EL LLAMADO RADIO DE STOKES, EL CUAL ES EL RADIO PROMEDIO DE LA PROTEÍNA EN SOLUCIÓN Y ES DETERMINADO POR LA CONFORMACIÓN DE LA PROTEÍNA.

90 LEY DE STOKES Es la fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos moviéndose en el seno de un fluido viscoso. La velocidad de los movimientos de dichos objetos es baja.

91 PROCEDIMIENTOS DIÁLISIS
FUNDAMENTO SE UTILIZA PARA SEPARAR MOLÉCULAS EN SOLUCIÓN MEDIANTE EL USO DE MEMBRANAS SEMIPERMEABLES QUE PERMITEN EL PASO DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS PERO NO DE LAS GRANDES.

92 DIÁLISIS PROCEDIMIENTO
LA SOLUCIÓN PROTÉICA ES COLOCADA EN UN TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS QUE SE AMARRA O SUJETA POR UN EXTREMO. EL OTRO EXTREMO SE SELLA O AMARRA UNA VEZ QUE SE HA COLOCADO LA MUESTRA Y SE COLOCA EL TUBO O BOLSA EN UN GRAN VOLUMEN DE AGUA O BUFFER (GENERALMENTE 500 A 1000 VECES MÁS GRANDE QUE LA CANTIDAD DE MUESTRA EN EL TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS).

93 DIÁLISIS FUNDAMENTO LOS SOLUTOS DE BAJO PESO MOLECULAR DIFUNDEN FUERA DEL TUBO DE DIÁLISIS. EL BUFFER O AGUA DIFUNDE HACIA ADENTRO DEL TUBO. LA SOLUCIÓN PROTÉICA DE ADENTRO DEL TUBO A MENUDO ES DILUIDA DURANTE LA DIÁLISIS DEBIDO A DIFERENCIAS EN FUERZA OSMÓTICA ENTRE LA SOLUCIÓN Y EL AGUA O BUFFER DE LA DIÁLISIS

94 APLICACIONES DEL MÉTODO DE DIÁLISIS
SE PUEDE UTILIZAR ESTE MÉTODO PARA CONCENTRAR PROTEÍNA ENVOLVIENDO LA BOLSA DE DIÁLISIS CON POLIETILENGLICOL, EL CUAL ABSORBE AGUA Y CONCENTRA LA SOLUCIÓN DENTRO DE LA BOLSA DE DIÁLISIS. EL EQUILIBRIO DE LA DIÁLISIS SE PUEDE USAR PARA DETERMINAR LA ESTEQUIOMETRÍA DE LA UNIÓN PROTEÍNA-LIGANDO.

95 GELIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
CASO DE LA CASEÍNA DE LA LECHE FUNDAMENTO EL QUESO ES LA CUAJADA DE LA LECHE, BÁSICAMENTE UN GEL DE CASEÍNA .

96 FORMACIÓN DE LA CUAJADA
SE BASA EN LA ACIDIFICACIÓN DE LA LECHE MEDIANTE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS. LAS ENZIMAS ACTÚAN EN UN RANGO ÓPTIMO DE 36-39ºC. SE SUELEN UTILIZAR UNA MEZCLA DE QUIMOSINA Y PEPSINA DE CERDO CON UNA ENZIMA COAGULADORA OBTENIDA DE UN HONGO.

97 FORMACIÓN DE LA CUAJADA
LA ENZIMA INICIA EL PRIMER PASO EN LA CONVERSIÓN DE LAS MICELAS DE FOSFOCASEINATO DE CALCIO DISPERSAS EN FORMA COLOIDAL EN EL QUESO. LAS MICELAS DE CASEÍNA EN LA LECHE PUEDEN DESESTABILIZARSE POR LA ENZIMA QUIMOSINA. ÉSTA ES EL INGREDIENTE ACTIVO EN LAS GOTAS O TABLETAS DE CUAJO.

98 EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIÓN DEL QUESO
LA QUIMOSINA ES RESPONSABLE DE LA PRIMERA ETAPA EN LA COAGULACIÓN DE LA LECHE. CAUSA LA DIVISIÓN DE UN ENLACE ESPECÍFICO, EL ENLACE PEPTÍDICO DE FENIL-ALANINA-METIONINA. ROMPE LA PORCIÓN ÁCIDA RICA EN CARBOHIDRATOS DE LA MOLÉCULA DEL RESTO HIDROFÓBICO PRIMARIO O para-k- CASEÍNA.

99 EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIÓN DEL QUESO
CON LA PÉRDIDA DE LA PORCIÓN ÁCIDA DE LA MOLÉCULA, EL RESTO DE LA k-CASEÍNA YA NO ESTABILIZA LAS MICELAS. ÉSTAS SE APROXIMAN UNAS A OTRAS Y SE UNEN, PROBABLEMENTE POR ENLACES HIDROFÓBICOS Y FORMAN UNA RED TRIDIMENSIONAL QUE ATRAPA LA FASE ACUOSA DE LA LECHE.

100 EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIÓN DEL QUESO
LA QUIMOSINA NO DESPLAZA AL CALCIO DE LA MICELA. EL COAGULO DE LA LECHE FORMADO POR LA ACCIÓN DEL CUAJO ES EL FOSOFOCASEINATO DE CALCIO. EL GEL FORMADO POR EL CUAJO ES FIRME, ELÁSTICO.

101 TEMPERATURA ÓPTIMA DE FORMACIÓN DE LA CUAJADA
LA LECHE NO DEBE SOBRECALENTARSE ANTES DE AÑADIR EL CUAJO DEBIDO A QUE SI SE FORMA GEL ÉSTE SERÁ DÉBIL DEBIDO, EN PARTE, A UN COMPLEJO INDUCIDO POR EL CALOR ENTRE LA β-LACTOGLOBULINA Y LA k-CASEÍNA. ÉSTA ÚLTIMA SE HACE RESISTENTE AL EFECTO DE LA QUIMOSINA.