Descargar la presentación
La descarga está en progreso. Por favor, espere
1
Espectrometría de Masa
Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 3 de mayo de 2013
2
Bibliografía recomendada:
Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002.
3
4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS
Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS
4
Espectrometría de masa
1- Generalidades
5
separación y determinación de la relación masa/carga de
Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos
6
emisión de energía radiante)
Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)
7
Espectrometría de masa de Biomoléculas
Determinación de masa y/o composición: Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos Lípidos Lipidoma Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material
8
Espectrometría de masa de Proteínas
Determinación de masa y/o composición Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento Niveles de expresión/modificación posttraduccional
9
Gel 2D de hígado humano
10
Espectrometría de masa
cyt C ~ Da
11
Espectrometría de masa biológica
Lisozima
12
Los Iones son importantes
Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones cambios en m/z: [M+H]+ o [M-H]- De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)
13
PM(péptido) = 1162 Da Espectrometría de masa Modo positivo
Modo negativo m = -1
14
Espectrómetro de masa Espectrometría de masa Muestra MALDI TOF ESI
Entrada: Volatilización/ Ionización Analizador de masas Detector MALDI ESI TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Sector Magnético Alto Vacío
15
¿Cómo volatilizar una proteína?
Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)
16
Espectrómetros de masa
Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance
17
Espectrometría de masa
2- MALDI-TOF
18
Ionización por MALDI: Espectrometría de masa
(Matrix assisted Laser desorption/ionization) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico
19
Espectrometría de masa
MALDI-TOF Matriz
20
Desorción/Ionización por Laser
Espectrometría de masa MALDI Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz
21
t (m/z)1/2 MALDI-TOF Espectrometría de masa
Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)
22
MALDI-TOF Ek = zeEs t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2
Espectrometría de masa MALDI-TOF Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek, ½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2
23
MALDI-TOF E + - Espectrometría de masa Sin E, iones a la deriva
Fig. Separación por TOF + + + + s D Detector Fuente ½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2
24
Espectrometría de masa
Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky
25
Espectrometría de masa
Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Carlos Cerveñansky
26
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
27
Espectrometría de masa
MALDI-TOF Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF
28
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
29
Resolución en MALDI-TOF
Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Carlos Cerveñansky
30
Los Isótopos son importantes
Espectrometría de masa Los Isótopos son importantes Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu), se basa en una escala relativa al 126C = 12 amu 1 amu = 1 dalton = x g Abundancia isotópica: 12C % 13C %
31
Elemento Masa % 1H 1.0078 99.985 2H 2.0141 0.015 12C 98.90 13C 1.10 14N 99.634 15N 0.366 16O 99.762 17O 0.038 18O 0.200 31P 100.00 32S 95.02 33S 0.75 34S 4.21 36S 0.02 79Br 50.69 81Br 49.31 Carlos Cerveñansky
32
Carlos Cerveñansky
33
Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina.
100 5725 5729 5733 5737 5741 5745 Mass (m/z) 2093 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % Intensity Voyager Spec #1=>MC[BP = , 12005] 2xC13 C12 C13 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= FWHM) Carlos Cerveñansky
34
Espectrometría de masa
MALDI-TOF
35
Espectrometría de masa
3- ESI-MS
36
ESI-Q Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization - Quadrupole
Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo
37
Espectrometría de masa
ESI N2
38
Espectrometría de masa
ESI
39
ESI-Q Espectrometría de masa
Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000
40
Espectrometría de masa
ESI-Q
41
Espectrometría de masa
ESI-Q
42
Espectrometría de masa
ESI-Q
43
ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
44
ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
10+ 9+ 11+ 13+ 12+ 14+ 10+ 9+ 11+ FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)
45
ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1) n = (x2-1)/(x1-x2) n = ( ) / 72.1 = 15 M = ( x 15) -15 = 17328
46
ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro
Mioglobina de caballo
47
ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Bajo PM
Alto PM
48
Espectrometría de masa
ESI-MS
49
Comparación ESI-MS y MALDI-TOF
Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C
50
Comparación Espectrometría de masa MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Cargas/ion
Pocas, en general 1 Muchas Rango de m/z 50000 3000 Rango de masas 70.000 Interacciones no covalentes No Si MS/MS limitado, PSD Si, CID Acoplar LC Tolerancia a contaminantes
Presentaciones similares
© 2024 SlidePlayer.es Inc.
All rights reserved.