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1 Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad.

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1 1 Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 8 de mayo de 2014

2 2 Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, Mass spectrometry in structural biology and biophysics, 2nd Ed, Kaltashov & Eyles, Cap. 3

3 3 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS tandem MS Espectrometría de masa

4 4 1- Generalidades Espectrometría de masa

5 5 Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos Espectrometría de masa

6 6 Espectrometría Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

7 7 Espectrometría de masa Determinación de masa y/o composición: Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares Polisacáridos, oligosacáridos Lípidos Lipidoma Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar g-ng (y menos) de material Espectrometría de masa de Biomoléculas

8 8 Espectrometría de masa Determinación de masa y/o composición Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos Modificaciones postraduccionales Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM Plegamiento Niveles de expresión/modificación posttraduccional Espectrometría de masa de Proteínas

9 9 Gel 2D de hígado humano

10 Masa (definiciones) Se determina m/z q = ±ze, e = x coulomb z siempre es un integral positivo 10

11 Masa Todas las moléculas tienen una composición química única, pero presentan una heterogeneidad física debido a la presencia de isótopos (mismo número de protones pero diferente número de neutrones) 11 C 13 6 C 14 6 C 12 6 C

12 12 ElementoMasa% 1H1H H2H C C N N O O O P S S S S Br Br Carlos Cerveñansky

13 Masa La fracción de isótopos pesados en elementos abundantes en moléculas biológicas (CHONP) no sobrepasan el 1% Sin embargo, en moléculas grandes, las contribuciones de los elementos pesados se vuelven importantes 13

14 Ejemplo: 12 C (98.9%) y 13 C (1.1%) En Buckminsterfullereno (C60) La probabilidad que todos los átomos sean 12 C: P = (0.989) 60 = Masa

15 15 Masa

16 16 Masa

17 Masa: definiciones Masa molecular se mide en unidades de masa atómica unificadas (u) u = m( 12 C) /12 = × kg (u es equivalente a 1 g/mol, y a Da, también se usaba a.m.u., considerado ahora arcaico) Peso atómico: promedio por composición isotópica Peso molecular Masa nominal: masa calculada con los isótopos más livianos, redondeado al entero Masa más abundante Masa promedio 17

18 18 Carlos Cerveñansky Masa: definiciones

19 19 Masa: definiciones

20 20 Una sola carga: Delta = 1.0 amu Determinación del número de cargas (z) m/z

21 21 Dos cargas: Delta = 0.5 amu m/z Determinación del número de cargas (z)

22 22 Espectrometría de masa de proteínas 37 kDa amu

23 23 Los Iones son importantes Espectrometría de masa [M+Na] +, [M+K] +, [M+NH 4 ] +, [M+Cl] - De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M+H] + o [M-H] - De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H] 2+, [M+nH] n+ ) En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones cambios en m/z: [M] *+, [M] *- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

24 24 Espectrometría de masa M (péptido) = 1162 Da Modo positivoModo negativo m =

25 25 Espectrómetro de masa Espectrometría de masaEntrada:Volatilización/Ionización AltoVacío Analizador de masas Detector Muestra MALDI ESI TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Orbitrap Sector Magnético

26 26 ¿Cómo volatilizar una proteína? Espectrometría de masa Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

27 27 Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) Espectrometría de masa MALDI-TOF: MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap FT-MS FT-MS: ESI-Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance Orbitrap: Orbitrap: ESI-orbitrap

28 28 2- MALDI-TOF Espectrometría de masa

29 29 Ionización por MALDI: Espectrometría de masa (Matrix assisted Laser desorption/ionization) (Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:

30 30 Ionización por MALDI: Espectrometría de masa La energía agregada hace que la matriz explote, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H +. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

31 31 MALDI-TOF Espectrometría de masa Matriz: acidos aromaticos

32 32 Espectrometría de masa 4HCCA DHBA SA

33 33 MALDI-TOF Espectrometría de masa Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su tiempo de vuelo(t). t (m/z) 1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

34 34 MALDI-TOF Espectrometría de masa Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: E k = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. Fuente Detector + E + - s D +

35 35 MALDI-TOF Espectrometría de masa Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. E k = zeEs = ½mv 2 v = (2zeEs/m) ½ Fuente Detector Fig. Separación por TOF ++ + E + - s D + Sin E, iones a la deriva

36 36 MALDI-TOF Espectrometría de masa Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. Los iones con igual carga tienen la misma E k, v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D m/z = 2eEs(t/D) 2

37 37 MALDI-TOF Espectrometría de masa ½mv 2 = zeEs v = (2zeEs/m) ½ t = D/v = (m/2zeEs) ½ D m/z = 2eEs(t/D) 2 Fuente Sin E, iones a la deriva Detector Fig. Separación por TOF ++ + E + - s D +

38 38 Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Espectrometría de masa Carlos Cerveñansky

39 39 Tubo de vuelo Detector 4-25 kV Espectrometría de masa Carlos Cerveñansky Los iones con mayor m/z se mueven más lento, mayor t

40 40 MALDI-TOF Espectrometría de masa Generalmente se observa la especie monocargada (M+H) +

41 41 MALDI-TOF Espectrometría de masa Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF Se pueden distinguir proteinas en una mezcla por su MM

42 42 MALDI-TOF Espectrometría de masa Se pueden estudiar masas en un amplio rango

43 43 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Resolución en MALDI-TOF Carlos Cerveñansky

44 44 3- ESI-MS Espectrometría de masa

45 N2N2 45 ESI Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N 2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray)

46 N2N2 46 ESI Espectrometría de masa ElectroSpray Ionization Por acción del gas secante y del vacío, el solvente se va evaporando y generando gotas más pequeñas muy cargadas que estallan para formar gotas aún más pequeñas hasta que quedan sólo proteínas cargadas que son dirigidas hacia el analizador

47 47 ESI-Q Espectrometría de masa Al analizador de masas de Cuadrupolo (Q) se le llama Filtro de Masas porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas

48 48 ESI-Q Espectrometría de masa Variando las señales eléctricas del cuadrupolo es posible variar la m/z que tiene trayectoria estable y realizar un barrido espectral Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, pero no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

49 49 Espectrometría de masa Trampa de iones Analizador de masas muy utilizado con ESI, atrapa los iones mediante voltajes oscilantes en los electrodos, enfocando los iones en el centro de una caja.

50 50 ESI-MS Espectrometría de masa La ionización de proteínas por ESI generar iones con diferente número de cargas, por adición de diferente número de protones m/z = (M+n)/n Donde n es el número de protones (masa = u, ~ 1)

51 ESI y carga

52 52 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

53 53 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

54 54 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro x 1 = (M+n)/n x 2 = (M+n+1)/(n+1) n = (x 2 -1)/(x 1 -x 2 ) n = ( ) / 72.1 = 15 M = ( x 15) -15 = n+n+ (n+1) +

55 55 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo

56 56 ESI-MS Espectrometría de masa Deconvolución del espectro Bajo PM Alto PM

57 57 ESI-MS Espectrometría de masa Resolución de varias especies

58 58 Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C

59 59 Comparación Espectrometría de masa MALDI-TOF ESI-(Q3 o IT) Cargas/ionPocas, en general 1Muchas Rango de m/z Rango de masas Interacciones no covalentes NoSi MS/MSlimitado, PSDSi, CID Acoplar LCNoSi Tolerancia a contaminantes SiNo

60 60 Conclusión Espectrometría de masa Permite determinar la masa molecular con muy alta resolución La espectrometría de masa es la técnica de elección para determinar la masa molecular de proteínas

61 Continuará… 61

62 62 Seroalbúmina humana Lucía Turell

63 63 Seroalbúmina humana Lucía Turell


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