Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores.

Presentación del tema: "Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores."— Transcripción de la presentación:

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2 Iniciación de la replicación en eucariotas: iniciadores y replicadores

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11 ¿cuál es la molécula iniciadora?

12 ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex Stephen P. Bell & Bruce Stillman Cold Spring Harbor Laboratory Nature, 357 (1992), 128

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16 ¿Qué pasa en eucariotas superiores? Donde se relata como sapos y moscas precipitan el derrumbe...

17 Experimentos de Harland and Laskey

18 Cualquier pedazo de DNA humano de un tamaño suficiente confiere a un plásmido la habilidad para ser replicado. En estos casos la replicación comienza en sitios localizados al azar, no sólo en la porción de DNA humano sino en la secuencia del plásmido bacteriano. Estos resultados sugieren que no se requeriría una secuencia consenso para iniciar la replicación en células de mamíferos.

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20 Estructura del gen de la beta globina Clonado de diferentes regiones del gen beta globina en un vector de expresión que contiene promotores para la RNA polimerasas de fagos T7 y T3

21 Preparación de sondas complementarias a las cadenas (+) o (-) de diferentes regiones del gen de beta globina. Se obtienen a partir de la transcripción in vitro de los clones con diferentes regiones del gen de beta globina

22 Células permeabilizadas+BrdU+emetina Extracción DNA Fragmentación (500 pb) Gradiente de CsCl DNA híbrido Separación por anti-BrdU Blotting en filtros Hibridización con sondas (+) y (-)

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24 Células de pacientes con hemoglobina Lepore

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28 Conserved Initiator Proteins in Eukaryotes Kimberley A. Gavin, Masumi Hidaka, Bruce Stillman Science, Vol 270, Issue 5242, 1667-1671 8 December 1995 The origin recognition complex (ORC), a multisubunit protein identified in Saccharomyces cerevisiae, binds to chromosomal replicators and is required for the initiation of cellular DNA replication. Complementary DNAs (cDNAs) encoding proteins related to the two largest subunits of ORC were cloned from various eukaryotes. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc1p were cloned from the budding yeast Kluyveromyces lactis, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe,and human cells. These proteins show similarity to regulators of the S and M phases of the cell cycle. Genetic analysis of orc1 + from S. pombe reveals that it is essential for cell viability. The cDNAs encoding proteins related to S. cerevisiae Orc2p were cloned from Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, and human cells. The human ORC-related proteins interact in vivo to form a complex. These studies suggest that ORC subunits are conserved and that the role of ORC is a general feature of eukaryotic DNA replication.

29 Paradoja de la especificidad del replicador (ORC)

30 Mecanismos que determinan la unión específica de ORC... o posibles respuestas a la paradoja Distintos tipos de ORC Concentración de ORC Actividad transcripcional Metilación del DNA y acetilación de histonas Intervención de otras proteínas

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34 Preguntas con respuestas pendientes en el área de la replicación ¿Existen orígenes de replicación definidos en eucariotas? ¿Cómo se logra la especificidad de la proteína iniciadora ORC?

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36 La replicación del DNA y el ciclo celular

37 Otra pregunta con respuesta abierta: ¿Cómo se regula la actividad de los orígenes de replicación de modo de obtener una sóla replicación por ciclo celular? “Once, and only once”

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40 Experimentos de fusión celular

41 Entender la naturaleza del estado competente (G1) Cual es la naturaleza del activador de S Caracterizar el estado de incompetencia (G2) Caracterizar el desbloqueo y regreso a la competencia

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47 Letters to Nature Nature 430, 913-917 (19 August 2004) | doi: 10.1038/nature02813 Structural basis for inhibition of the replication licensing factor Cdt1 by geminin Changwook Lee 1, BumSoo Hong 1,5, Jung Min Choi 1,5, Yugene Kim 1, Saori Watanabe 2, Yukio Ishimi 3, Takemi Enomoto 2, Shusuke Tada 2, Youngchang Kim 4 and Yunje Cho 1 1 5 15 1 2 3 2 4 1

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