Curso de doctorado “Estructura y Función de Macromoléculas”

Presentación del tema: "Curso de doctorado “Estructura y Función de Macromoléculas”"— Transcripción de la presentación:

1 Curso de doctorado “Estructura y Función de Macromoléculas” TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS Motores de búsqueda con datos de fragmentación de péptidos. Interpretación de resultados. Alberto Jorge García Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica CBM-SO. CSIC-UAM

2 Curso Práctico De Identificación de Proteínas con Datos de Espectrometría de masas: Herramientas Bioinformáticas Motores de búsqueda con datos de fragmentación de péptidos. Interpretación de resultados. Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro de Biología Molecular Severo Ochoa CSIC-Universidad Autónoma de Madrid

3 Motores con los que vamos a trabajar:
Sequest: Se necesita licencia; desarrollado por Yates y col., comercializado por Thermo en el paquete “Bioworks”. Mascot: Disponible en red; desarrollado por Pappin y col., se puede comprar la licencia. Emplean distintos algoritmos de búsqueda

4 SEQUEST Abrir BioWorks Browser
Fichero de datos como ejemplo : trypmyo01.raw Abrir BioWorks Browser Doble click

5 File  Open  D:/…/Siena  trypmyo01.raw
“Cromatograma” Análisis LC-MS Modo de trabajo más común, TRIPLE PLAY: Full ms-Zom scan-ms/ms

6 Display  Configuration Settings  D:\Siena\Myo1
Previamente hemos creado la carpeta donde se van a guardar los resultados

7 Qué información tenemos acerca de nuestra muestra?
Caso más simple: PROTEÍNA ÚNICA Complejidad de la mustra Organismo Método de digestión Preparación de la muestra Digerido de una única proteína Caballo tripsina No alquilación

8 Actions  TurboSEQUEST Search
Scan nº 449 Seleccionamos un espectro ms/ms con una “buena calidad”

9 Selección de parámetros de búsqueda SEQUEST: básicos
Configuration settings Siena/myo1 Generamos ficheros .dta a partir del/ los ficheros .raw 449 Parámetros de búsqueda

10 Resultados SEQUEST Double click

11 Cobertura de Secuencia
Nuestro péptido

12 Calidad de la identificación
Doble click

13 El fragmento más intenso no se asigna!?
El programa asigna los iones de las series principales en el espectro El fragmento más intenso no se asigna!?

14 Conclusión: Muy buena asignación
Hay que tener en cuenta la presencia de iones doblemente cargados Conclusión: Muy buena asignación

15 Identificación de proteínas en la muestra ‘trypmyo01’
Aumentamos la complejidad: IDENTIFICACIÓN DE PROTEíNAS EN NUESTRA MUESTRA Identificación de proteínas en la muestra ‘trypmyo01’ Búsqueda SEQUEST : - Rápida - Máxima cobertura de proteínas

16 Tenemos la posibilidad
Selección de parámetros de búsqueda SEQUEST: básicos Seleccionamos un rango amplio del análisis que incluye un alto nº de scans ms/ms Tenemos la posibilidad de trabajar con DB inde xadas.

17 Que supone indexar una base de datos?
Trabajar con bases de datos cuyas proteínas están digeridas “in silico” Seleccionamos la base de datos (disponibles en red y en Bioworks) Conviene ir actualizando las DB Seleccionamos la proteasa (comúnmente tripsina) Seleccionamos las modificaciones: fijas y/o variables. Depende del tratamiento de la muestra Herramienta disponible en Bioworks: Tools Aumenta notablemente la rapidez de la búsqueda

18 Selección de parámetros de búsqueda SEQUEST: advanced
dta generation Precursor mass 1.4 Group scan 1 Min group count 1 Min ion count 35 Tolerance for dta search Peptide 1.5 Fragment 0.35 Ion series a,b,y Output Report duplicate ref.

19

20

21 Resultados de la búsqueda SEQUEST
Mayor nº de péptidos asignados Dtas generados Proteína con mayor puntuación

22 Sort Resultados SEQUEST
Display  Options  Sort Ordenamos los péptidos por puntuación

23 los péptidos con XC>2 de la proteína con mayor
Filter Resultados SEQUEST Display  Options  Filter Seleccionamos solo los péptidos con XC>2 de la proteína con mayor puntuación

24 Revisión de la proteina con mayor puntuación Cobertura de secuencia
Double click

25 Cobertura de secuencia 89%

26 Cómo comprobar si un “match” es bueno o malo?
Scan : no es el péptido de la proteína con mayor puntuación pero es el nº1 de los 10 mejores de su lista de SEQUEST Doble click

27 Listado de los 10 mejores “hits” SEQUEST para #341
Note: XC values ‘Ions’

28 1st mejor “match” por SEQUEST LFTGHPETLEK
Todos los iones mayoritarios se asignan correctamente a las series principales b- e y”-ion Veredicto: asignación correcta

29 mayoritarios sin asignar a las series principales
2nd mejor “match” por SEQUEST LIKEAAGKSNLK Quedan muchos iones mayoritarios sin asignar a las series principales

30 Conclusiones Espectro La intensidad del espectro es el primer “filtro”
La mayoría de los espectros de péptidos tienen una distribución ‘bell-shaped’ Ambas series (b- and y-ion) están presentes en el espectro Buen “match” Series b- e y-ion contigüas Todos los picos intensos se corresponden con la secuencia identificada XC “the bigger the better” DeltaCN muestra la capacidad de Sequest de discernir entre secuencias Sp es una puntuación preliminar, “the bigger the better” RSp value debe ser 1 péptidos +3 en general no son tan ‘bonitos’ como +2 péptidos +1 generalmente son de secuencia corta–el valor diagnóstico es menor

31 MASCOT Trabajamos en red

32 Formulario a completar: Parámetros de búsqueda
Importante si la red no va bien, Podemos recibir los resultados por correo NCBInr: mayor nº de entradas Mayor significatividad estadística Mucho cuidado con las modificaciones: anotar solamente las que conozcamos su presencia con seguridad Acepta datos en distintos formatos, ya tenemos creados los ficheros .dta No es necesario rellenar el resto de las casillas Importante para obtener buena tabla de resultados

33 Proteínas con puntuación fuera de la zona de incertidumbre
Resultados de la búsqueda MASCOT Proteínas con puntuación fuera de la zona de incertidumbre Mejor puntuación

34 “Peptide Summary Report” MASCOT
Mejor puntuación a mayor nº de péptidos asignados para la misma proteína Doble click Todas las proteínas con buena puntuación son proteínas muy relacionadas

35 “Peptide View” MASCOT

36