“Apoptosis inducida por Bid es inhibida por Bcl-2” Mariano Dellarole Fernanda Quinteros Laura Sifonios JBC, Vol. 18,No 19, 2003.

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2 “Apoptosis inducida por Bid es inhibida por Bcl-2” Mariano Dellarole Fernanda Quinteros Laura Sifonios JBC, Vol. 18,No 19, 2003.

3 La vida requiere de la muerte... Células dañadas Infectadas Redundantes Eliminación por un programa de suicidio celular : Apoptosis. Involucrada en : Desarrollo normal Homeostasis de tejidos Defensa contra patogenos Su desregulación puede producir: Cáncer Enfermedades autoinmunes Enfermedades degenerativas

4 * La familia de las proteínas Bcl2 son reguladores de la apotosis *Presentan dominios de homología Bcl2 (BH). *Antecedentes documentados del bloqueo de la apoptosis por Bcl2 * Bid procesamiento tBid proteoloítico (forma activa) Traslocación Inserción en la membrana mitocondrial Liberación citocromo c Apoptosis (Caspasa 8)

5 Bcl-xl La Familia de Bcl-2 Fuente: review de J. M. Adams, Science 1998 Vol 281

6 *Objetivo: Determinar los mecanismos mediante los cuales Bcl-2 inhibe la apoptosis inducida por Bid. *Modelo de expresión: HeLa cells pcDNABid pcDNABcl2 pcDNAEGFP

7 Figura 1: Objetivo: Determinar si Bcl2 inhibe la apoptosis inducida por Bid. Observación de la morfología. Análisis bioquímicos. Conclusión: Bcl2 inhibe la apoptosis inducida por Bid.

8 Figura 2: Objetivo: Estudiar el rol de Bcl2 sobre la liberación del citocromo cinducida por Bid Inmunoblot de fracciones subcelulares Inmunofluorescencia Conclusión: Bcl2 bloquea la liberación del citocromo c de la mitocondria inducida por Bid

9 Figura 3 Objetivo : estudiar el papel de Bcl-2 en el procesamiento proteolitico de Bid. Inmunoblot. Conclusión: Bcl-2 no evita el procesamiento de Bid..

10 Figura 4 Objetivo: determinar si Bcl-2 inhibe la translocación de Bid a la membrana mitocondrial. Inmunoblot de fracciones subcelulares. Conclusión: Bcl-2 no impide la translocación de tBid a la mitocondria.

11 Figura 5: Tratamiento alcalino: Fraccionamiento subcelular (digitonina) Organelas Carbonato ph 11.5 Centr. a 100.000g por 1 hora. Pellet: proteinas resistentes (integradas a mb.) Sn: proteinas liberadas (debilmente unidas a mb)

12 Figura 5: Objetivo: determinar si Bcl-2 inhibe la inserción de tBid a la membrana mitocondrial. Conclusión: Bcl-2 impide la inserción de tBid a la membrana mitocondrial. Densitometria de las bandas p15 (S1 y S2) Inmunoblot

13 Figura 6 Objetivo: determinar si Bcl-2 interactua directamente con tBid. Co-inmunoprecipitación de Bcl-2 y Bid/tBid. Inmunoblot. Conclusión: Bcl-2 no interactua con tBid.

14 Figura 7 tBid Bax/Bak Translocación a la mb. mitocondrial. Oligomerización Apoptosis Objetivo: Bcl-2 inhibe la translocación de Bak/Bax inducida por tBid? Inmunoblot de fraccionamiento subcelular. Conclusión: Bcl-2 impide la translocación de Bax a membrana mitocondrial.

15 Figura 8 célulascrosslinking digitonina pellet Fracción de organelas inmunoblot Objetivo: analizar el estado de oligomerización de Bak/Bax en la fracción de organelas. Conclusión: Bcl-2 bloquea la oligomirización de Bak/Bax inducida por Bid.

16 Fin de la historia: Tres eventos importantes son bloqueados por Bcl-2: Bcl-2 suprime la inserción de tBid a la membrana de la mitocondria. Bcl-2 inhibe la translocación desde el citosol a la mitocondria de Bax, inducida por Bid. Bcl-2 disminuye la oligomerización de Bax y Bak inducida por Bid. Chán, chán.