Vías de muerte.

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1 Vías de muerte

2 caspase cysteine-dependent aspartate specific protease Especificidad dominante para sustratos conteniendo Asp (específico de caspasas) Excepción: Granzima B: activador de caspasas Contienen un pentapéptido conservado: QACXG conteniendo la cisteína del sitio activo (común en cisteína proteasas) Horvitz y cols.: Caenorhabditis elegans CED CED CED9

3 CED 3: proteína pro-apoptótica con homología de
secuencia con: interleukin-1-converting enzyme (ICE)-like proteasas pro-IL-1 IL-1 por clivaje entre Asp 116-Ala 117. Para unificar la nomenclatura: CASPASAS Caspasa 1: primera caspasa identificada (la numeración de los aácidos de todas las caspasas se refiere a ella)

4 Procesamiento de caspasas
* Residuos esenciales para la catálisis  Residuos para reconocimiento de sustrato

5 Interrogantes acerca de la función de algunas caspasas
* Caspasa 2: iniciadora vía TNFR * Caspasas 4,5 y 13: rol desconocido Se las agrupa como activadoras de Citoquinas por su similitud con la secuencia con caspasa 1 Pero: caspasa 13 es activada por caspasa 8?? Significado fisiológico desconocido

6 Estructura primaria de las caspasas

7 Estructura primaria de caspasas

8 La familia de las caspasas

9 Activación de las pro-caspasas 7 y 9

10 Sustratos de caspasas Caspasas activ. de citoquinas (1, 4 y 5):(W/Y)EHD Caspasas iniciadoras (8, 9 y 10): (I/L/V)EHD Caspasas ejecutoras (3 y 7) y caspasa 2: DEXD Uso de sustratos selectivos en mezclas de caspasas Es complicado La actividad y abundancia de cada caspasa, determina el resultado. La estructura ternaria es relevante

11 Sustratos de Caspasas Elementos del citoesqueleto: actina, fodrina, proteína tau y catenina Enzimas encargadas de reparar (PARP) o degradar (DNAasa) el DNA Factores de transcripción: Rb, MDM2 Proteínas quinasa y fosfatasas: PKC, fosfatasas 2-alfa, Akt Productos de la familia Bcl-2 CAD-ICAD

12 Sustratos de caspasas

13 Sustratos e inhibidores de caspasas

14 Estructura de las caspasas
Heterodímeros: cada uno contiene un sitio catalítico compuesto por residuos de ambas subunidades Cada sitio activo contiene un S1 (+)(altamente conservado) para unir el Aspartato P1 (-) del sustrato P2 y P3 tienen un efecto limitado sobre el clivaje del sustrato P4 y S4 son relevantes en la especificidad por sustrato

15 Sustratos sintéticos Secuencia tetrapeptídica de preferencia de caspasas Sustratos sintéticos: tetrapéptidos conjugados a: 1) un cromóforo pNA (espectrofotometría) 2) un fluorocromo: AMC (7-amino-4-metilcumarina) AFC (7-amino-4- trifluorometil cumarina) (espectrofluorometría)

16 La secuencia tetrapeptídica es una secuencia de
“preferencia” y no absoluta Muchas caspasas pueden clivar el mismo sustrato “in vitro” aunque con distinta eficiencia. La elección depende de la concentración, tiempo de reacción y accesibilidad

17 Inhibidores Sintéticos
Se unen al sitio activo de las caspasas en forma reversible o irreversible Algunos forman uniones covalentes con la cisteína del sitio activo Bloquean o retrasan la muerte Pueden ser tóxicos para la célula (incub. t largos) Como ocurre con los sustratos de caspasas, los inhibidores no son específicos para una caspasa

18 Otros roles de las caspasas
Regulación de la diferenciación celular: FADD es un regulador clave del desarrollo de células T Proliferación celular ( de células T) y progresión del ciclo celular Motilidad celular Internalización de receptores (FAS R)

19 Mecanismos de activación de caspasas
Homoactivación: requiere del reclutamiento de zimógenos a proteínas adaptadoras: caspasas iniciadoras 8 y 10: DISC, mediado por R de muerte caspasa iniciadora 9: Apoptosoma, compuesto por Apaf1, citocromo c, dATP/ATP y caspasa 9 Heteroactivación: ocurre por acción de otras proteínas sobre los zimógenos caspasas

20 Dominios de Apaf-1 Card: se une al Card de caspasa 9
NBD: dominio de unión a nucleótidos, involucrado en la oligomerización WD40: involucrados en interacciones proteína- proteína

21 * El dominio CARD no está normalmente expuesto
y no se une a procaspasa 9 a menos que Apaf1 sea activado por dATP y citocromo c * El acceso al dominio CARD está normalmente bloqueado por las WD40 * ATP y cit.c hacen que Apaf-1 sufra un cambio con- formacional que expone el dominio CARD uniendo luego la pro-caspasa 9

22 Apoptosoma: la rueda de la muerte
El sitio de unión para Cit. c con Apaf-1 no ha sido caracterizado WD-40 regulan el sitio de unión La unión de Cit. C expone los sitios de unión para dATP

23 La homodimerización parece ser la clave para la
activación de la procaspasa 9 Un evento único es que sólo uno de los dos polipép- tidos se vuelve activo Probablemente los monómeros de procaspasa 9 unidos al apoptosoma recluten nuevos monómeros de procaspasa 9 para formar la holoenzima El apoptosoma permitiría la interacción antiparalela de dos monómeros inactivos para formar el dímero asimétrico activo

24 Interacciones caspasa 9-apoptosoma
Caspasa 9 libre: actividad mínima el apoptosoma actúa como holoenzima La actividad del zimógeno y la forma procesada aumentan 2000 veces por unión al apoptosoma Estequiometría Apaf-1/caspasa 9: 1:1 El procesamiento proteolítico en el linker no es necesario para la activación de caspasa 9 El dominio N-terminal no se corta, la caspasa puede permanecer asociada al apoptosoma y activar casp. ejecutoras

25 Vias de muerte

26 Niveles de regulación de las caspasas
Hay precursores de caspasas expresados en forma constitutiva deben estar estrechamente reguladas Los precursores de caspasas están presentes en una conformación que previene la autocatálisis 2) Necesitan de proteínas adaptadoras y cofactores que cambien su conformación y las vuelvan activas 3) Compartimentalización de caspasas y cofactores

27 Niveles de regulación de caspasas
Unión específica de inhibidores naturales: FLIP IAPs A diferencia de la familia Bcl-2, IAPs bloquean tanto la vía mitocondrial como la del R por unión a caspasas iniciadoras y efectoras

28 Localización de las caspasas
* Normalmente citosólica * También se han encontrado en: núcleo RE mitocondria Algunas caspasas pueden traslocarse de un compar- timiento celular a otro en presencia de un estímulo apoptótico Caspasas 2 y 9: de la mitocondria al citosol Caspasa 7: del citosol a la mitocondria

29 Las dos vías de muerte y sus inhibidores naturales

30 Miembros de la familia IAP
Para oponerse a la destrucción celular mediada por caspasas se cuenta con dos clases de inhibidores * Miembros de la familia Bcl-2: bloquean la vía mitocon- drial * Miembros de la familia IAP: bloquean la vía mitocon- drial y la vía del receptor Se unen a caspasas iniciadoras y efectoras e inhiben su actividad

31 Miembros de la familia IAP
NIAP:atrofia muscular espinal BIR: Cys/His RING, UBC: ubiquitin ligasa Degradación de caspasas unidas vía proteasoma

32 Inhibición de caspasas por IAPs

33 XIAP Es el más potente inhibidor de caspasas 3, 7 y 9
Aún no se conoce la función del dominio BIR 1 La región que circunda BIR 2 une específicamente caspasas 3 y 7 BIR 3 une caspasa 9 BIR 2 no tiene rol directo en la inhibición de caspa- sas

34 XIAP es una proteína modular

35 BIR3 de XIAP se une a la caspasa 9 clivada BIR 3 reconoce un tetra-
péptido Ala-Thr-Pro-Phe Este tetrapéptido también se encuentra en SMAC/DIABLO

36 La caspasa 3 cliva a la procaspasa 9

37 Posibles funciones de BIR 1
* Puede actuar estabilizando XIAP * Puede interactuar e inhibir caspasas aún no identificadas * Puede proveer una interfase para la unión de proteínas que interactúan con XIAP, modificando su actividad

38 ¿Porqué tener una proteína con diferentes
dominios que inhiban distintas caspasas? Permite la regulación simultánea de varias caspasas XIAP se une al apoptosoma donde interactúa con caspasas 9 y 3 sugiriendo que previene: * la activación de caspasa 3 por caspasa 9 * la liberación de la caspasa 3 del apoptosoma

39 XIAP se asocia con el apoptosoma
La proximidad de XIAP a caspasas 3 y 9 y el hecho de que distintos dominios inhiban caspasas 3 y 9 justificarían la alta eficiencia y potente inhibición de estas caspasas por XIAP

40 Inhibiendo a los inhibidores
SMAC/DIABLO Second Mitochondria derived Activator of Caspase Conecta a los IAPs con la MC controlada por la M Se sintetiza como un precursor que se trasloca a la mitocondria Allí se remueve un N-term de 55 aácidos (sec. de targeting) y se expone un tetrapéptido Ala-Val-Pro-Ile esencial para su unión a IAPs Interactúa con: XIAP, c-IAP ½ y survivina

41 Activación de caspasas por SMAC/DIABLO
El linker NH2-t de BIR2 ocupa el sitio de unión del sustrato de caspasas

42 XAF1: una proteína de interacción con XIAP
XIAP- Asociator Factor I Antagoniza la habilidad de XIAP para inhibir la actividad de caspasas “in vitro” A diferencia de SMAC/DIABLO no necesita ser procesado Está localizado en el núcleo y no se conoce el mecanismo de inhibición. Se propone que ocurre en el núcleo

43 Los dos mecanismos posibles de regulación de XIAP
Smac/Diablo: No tendría efecto Sobre la vía del Receptor XAF-1: su locali- zación nuclear sugiere que puede interceptar ambas vías apoptóticas

44 Miembros de la familia Bcl-2

45 Proteínas anti-apoptóticas
BH1-BH4: son indispensables para su actividad de supervivencia BH1-BH4: no tienen actividad catalítica pero intervie- nen en la interacción con otras proteínas BH1-BH3: forman un surco hidrofóbico en la parte funcional; BH4 interviene en la estabilización del bol- sillo hidrofóbico Si se remueve BH4 la proteína se transforma en pro- apoptótica

46 Miembros pro-apoptóticos
* Ante un estímulo apoptótico exponen su dominio BH3 mediante un cambio conformacional (Bcl-2 no puede hacerlo) * Este dominio BH3 es el que va a interaccionar con el bolsillo hidrofóbico de las proteínas anti-apoptóticas * El cambio conformacional puede ocurrir por: defosforilación: Bad clivaje: Bid * La consecuencia del cambio conformacional es la traslocación a la mitocondria

47 Bax: targeting, inserción, oligomerización y formación del canal
No hay canal canal

48 Modo de acción de Bcl-2-like y
Bax-like factors

49 El casposoma de C.Elegans
Modo de acción de una proteína BH3-only BH3-only Sensores y Mediadores de las res- puestas apoptóticas

50 Targeting de Bid y Bad a la mitocondria
(A): t-Bid se puede unir a Bax o Bcl-Xl (B): independiente de caspasas (C): un aumento en la conc. de Ca++ induce la calcineurina fosfatasa que defosforila Bad

51 Traslocación de proteínas en la apoptosis

52 Traslocación de proteínas durante la apoptosis

53 Fases en la decisión de la muerte celular

54 Cambios mitocondriales durante
la apoptosis Mecanismos de liberación de Citocromo c

55 Redistribución celular de la mitocondria Cambios morfológicos
Teñido de la mitocondria normal b) Mitoc. transfectadas con Bax e inhibidor general de caspasas: la mitocondria se condensa c) La mitocondria forma clusters alrededor del núcleo

56 Mecanismos de liberación de citocromo c
Se han postulado dos teorías: Teoría de la ruptura no específica de la MME PTP 2) Teoría de formación de canales conductores de citocromo c

57 Posibles componentes del PTP
Canal no selectivo BPR: receptor benzodiazepinas CK: creatina quinasa HK: hexoquinasa Cph. D: ciclofilina D

58 La apertura del PTP puede dispararse por efectores
fisiológicos como iones Ca, ROS, variaciones de pH, Bax Consecuencia: repentino incremento de la permeabilidad de MMI ( 1,5 kDa), disipación del potencial dependien- te de protones y desequilibrio químico entre citoplasma y matriz mitocondrial Estos eventos causarían un swelling de la matriz debido a su alta concentración de solutos conduciendo a la disrupción de la MME La ruptura de la MME ha sido raramente descripta y no explicaría la salida de proteínas del espacio intermembrana

59 Formación de canales conductores de cit. c
Las estructuras de Bcl-XL y Bid se asemejan a las de algunas toxinas que pueden formar canales para iones y proteínas Bcl-XL, Bcl-2, Bax y tBid forman canales funcionales en vesículas sintéticas Las propiedades intrínsecas de los canales formados por proteínas pro y anti-apoptóticas difieren significati- vamente. Esto explicaría sus influencias opuestas so- bre la liberación de citocromo c

60 Liberación del Cyt c de la mitocondria
c) Bax se oligomeriza y forma megacanales d) Bax coopera con VDAC para formar un gran canal e) Bax o tBid forman un poro lipídico o un complejo proteína lípido

61 Otras moléculas involucradas en al apoptosis

62 Traslocación de proteínas durante la apoptosis