P-53. P-53 P-53 Se descubre en 1979 oncogen (forma mutada e inactiva ) Gen supresor de tumores Integridad genómica Control en la progresión del ciclo.

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2 P-53

3 P-53 Se descubre en 1979 oncogen (forma mutada e inactiva ) Gen supresor de tumores Integridad genómica Control en la progresión del ciclo celular Sobrevida celular

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8 P-53 Presenta varias isoformas N-p53 carece dominio N terminal
( 40/47kDa) Actua como inhibidor dominante negativo de la Full Lenght p53

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10 IRES ( internal ribosomal entry sites )
Iniciacion de la traduccion CAP independiente (1988 picornavirus) Union directa de subunidad ribosomal 40s en un sitio interno sobre mRNA Se define por su funcion Tiene codon de iniciacion AUG Utilizacion de factores de iniciacion (ITAF )

11 IRES ( internal ribosomal entry sites )
Se reconoce a traves de ensayos utilizando construcciones bicistronicas Dos genes reporteros bajo un mismo promotor ( luciferasas ) Entre ambos la zona de probable IRES El primer reportero se va a traducir utilizando la estructura CAP,luego hay STOP Si encuentro el producto del segundo mensajero es que esa secuencia es un IRES

12 Los autores proponen que la traduccion en ambas isoformas se realiza a traves de dos IRES
5’ UTR para full-lenght Protein coding region para N-p53 Con distinta actividad en el ciclo celular

13 Objetivo: Identificacion de las secuencias IRES Ubicación en la secuencia completa del gen P-53

14 MFOLD algoritmo : estructuras secundarias
134 nt 5’ UTR 5’ 251 nt

15 Metodo : Transcripcion In Vitro
Plasmido monocistronico GFP gen reportero ( downstream ) RNA polimerasa T7 Presencia / ausencia de analogo de CAP

16 Metodo: Transfecciones utilizando construcciones monocistronica
DNAs 5’251 y 134 nt P-53 RNAm de sangre de individuos sanos Clonado en el vector pCDNA 3 con GPF HCV – IRES - GFP

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18 Al agregar analogo de CAP :
No inhibe la traducccion del +39 Inhibe parcialmente la –1 Si inhibe a la GFP - CAP

19 resultado Con o sin analogo de CAP se observa traduccion
Estos resultados indican que el p y –1 permiten el inicio de la traduccion CAP independiente ( dos sitios IRES )

20 Objetivo: comprobar que el inicio de la traducción de la proteína P53, se realiza mediante IRES, en el extremo 5’ UTR. Material y métodos: se utilizo plasmidos bicistronicos, con 2 genes reporteros Rluc y Fluc, promotor y secuencia P53 +1, P

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22 2da Hipótesis: descartar que las secuencias 5’UTR P53, no se
Realiza a través de la lectura ribosomal Cap dependiente. 2do plasmido denominado PrDEp53(+39) y PrDEp53(+1), Se agrego secuencia regulatoria del virus de la encéfalo miocarditis que inhibe la traducción por CAP y un control interno con PrDEF

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24 Luego se descarto la traducción del 2do cistron, colocando
el EMCV Rio arriba

25 resultado La traducción de P53 (+39) y P53(+1)
se realizo a partir del IRES en la posición 5’UTR.

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27 3ra hipótesis: descartar que la traducción mediada por
p53 (+39) es independiente de la mediada por p53 (+1). Material y métodos: se utilizo plasmidos con construcciones Bicistrónicas, mutando a +1 ATG por AAG. Y un control WT p53 AAG

28 resultado no se encontró cambios significativos de la actividad
Fluc, comparada con WT. Ambos genes se traducen de manera independiente

29 objetivo Descartar la posibilidad de que la actividad Fluc del ADN bicistrónico p53 (+39) sea debida a la presencia de sitios splice o promotores crípticos

30 Metodo Tranfeccion: RNA celulas Hela transfectadas con
plasmidos bicistronicos con ensayo con luciferasa Infeccion con virus vaccinia ( con promotor T7) en contrucciones eucarioticas sin promotor Sincronizacion: Despues de 24 hs , nocodazole G2/ M o Timidina en fase S

31 Metodo RT-PCR dos primers P1 3’ RLUC P2 3’ FLUC P3 5’ RLUC P4 5’ FLUC
Northern blot P-53 (+39 ) P-53 (-1 ) CVB3 IRES Control FLUC ARN

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34 resultado Observaron presencia de ARN bicistrónico completo y no pequeños ARN Demostraron que los cistrones eran parte de una transcripción única

35 Pero hay actividad Fluc posiblemente por pequeñas cantidades de transcriptos monocistrónicos generados por el segundo cistrón , no detectados por estos análisis de ARN

36 Metodo Transfección de células Hela con plásmido bicistrónico pBS-Rp53(+39) que carece de promotor eucariota pero tiene promotor T7 Demuestra la ausencia de promotores crípticos en la secuencia 5’UTR p53 que lleve a la transcripción de ARN Fluc Infeccion con virus vaccinia ( T7 – ARN polimerasa )

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38 En presencia del virus vaccinia fue alta la actividad de Fluc y Rluc
El control null negativo mostró actividad de Rluc pero es no activo sin este virus El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53

39 El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53

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41 Se investigó la actividad de los IRES que median la traducción de ΔN-p53 y de p53 completa en las diferentes fases del ciclo celular. Para ello se trasfectaron células HeLa con plásmidos bicistrónicos pRp53(+39)F (regula ΔN-p53) o pRp53(-1)F (regula p53 completa) Las células fueron detenidas en la transición entre la fase G2 y M con Nocodazole.

42 REGULACIÓN DE IRES DE P53 DEPENDIENTE DE LA FASE DEL CICLO CELULAR
Se liberó el bloqueo del ciclo celular Se evaluó la actividad de luciferasa en diferentes tiempos para cada uno de los vectores Se evaluó el ciclo celular en diferentes tiempos mediante citometría de flujo

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44 RESULTADOS La actividad de luciferasa de p53(+39)IRES (regula ΔN-p53) fue máxima a las 24 hs. Coincide con el mayor número de células en fase S (citometría de flujo-24 hs) Sugiere que la actividad de p53(+39)IRES es máxima durante la progresión a fase S El nivel de la proteina ΔN-p53 alcanza su punto máximo en fase S

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47 RESULTADOS La actividad de luciferasa de p53(-1)IRES (regula p53 completa) fue máxima a las 0 hs y a las 42 hs Coincide con el mayor número de células en la transición entre G2 y M (citometría de flujo-0 hs y 42 hs) Sugiere que la actividad de p53(-1)IRES es máxima durante la transición entre G2 y M

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50 El experimento se repitió bloqueando el ciclo celular en G1 mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

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55 Discusión La traducción mediada por IRES es un mecanismo alternativo de iniciación de la traducción del mRNA celular Constituye una forma de regulación de la expresión génica bajo diferentes condiciones fisiológicas

56 Discusión El gen p53 juega un rol fundamental en la progresión del ciclo celular Cumple funciones de checkpoint en G1/S y G2/M La isoforma N-p53 se encuentra altamente expresada en el comienzo de la Fase S Puede facilitar la transición G1-S por inhibición de la actividad wild-type p53

57 Discusión Este trabajo demostró que el incremento de la actividad del IRES en la transición G1-S resulta en altos niveles de N-p53 Esto provoca un efecto negativo sobre la actividad del gen completo de p53 La isoforma N-p53 es resistente a la degradación mediada por Mdm-2

58 Discusión La traducción del gen completo p53 mediada por IRES, muestra una alta actividad en la transición G2-M Este es un mecanismo alternativo de síntesis de proteínas Sería responsable de síntesis de niveles basales de p53

59 Discusión La traducción del gen completo p53 mediada por IRES es baja G2-M Pequeños aumentos en la síntesis del gen completo p53 serían degradados por Mdm-2 Este mecanismo permite la progresión a la siguiente fase del ciclo celular

60 Discusión Este trabajo propone la existencia de dos IRES que mediarían en la traducción de dos isoformas diferentes de la misma p53 Los autores no descartan la existencia de un solo IRES en p53 mRNA La iniciación de la traducción podría darse a nivel de dos codones diferentes

61 Discusión La interacción de diferentes ITAFs con IRES celulares, es un importante mecanismo de regulación de la iniciación de la traducción Varias proteínas, incluída la misma p53 interactúan con el extremo 5’UTR de p53 mRNA

62 Discusión La interacción de p53 con 5’UTR inhibe la traducción de p53 mRNA Es una función de control autoregulatorio negativo

63 Discusión La producción de p53 mRNA es alta en G1-S, pero alcanza su pico máximo en la mitad de Fase S Esto sugiere que la proporción relativa de p53 y N-p53 puede ser decisiva en la regulación de la traducción de p53

64 Discusión Altos niveles de N-p53 producidos en la transición G1-S por la actividad de (+39) IRES, puede prevenir la unión de full-length p53 al extremo 5’UTR De esta manera se permite la producción de full-length p53 en medio de la Fase S

65 Discusión La síntesis de niveles suficientes de full-length p53 que interactúa con 5’UTR del mRNA: - Inhibe la traducción - Genera un feedback negativo - Permite el ingreso a la fase G2/M del ciclo celular

66 Discusión Este modelo sugiere una intrincada regulación de la expresión del gen p53 por interacciones de la proteína-RNA Esto sucede para permitir la progresión normal del ciclo celular, mediante controles checkpoints de dicho ciclo ante un daño del DNA

67 Discusión Recientemente, otras dos proteínas, la proteína ribosomal L26a y la Nucleolina demostraron interactuar con p53 5’UTR, modulando así la traducción Ambas proteínas también interactúan con IRESs virales

68 Conclusiones Estudios futuros sobre el rol de éstas y de otras proteínas interactuantes p53-IRES podrán proveer información sobre la regulación de la expresión del gen p53 en condiciones fisiológicas y de stress

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