Expresión del material genético: de la transcripción a la traducción

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1 Expresión del material genético: de la transcripción a la traducción
CAPÍTULO 11 Expresión del material genético: de la transcripción a la traducción

2 Imagen de inicio de capítulo.
Modelo de la subunidad grande de un ribosoma procariota a una resolución de 2.4 Å mediante cristalografía de rayos X. Esta vista se enfoca en el espacio del sitio activo de la subunidad grande que consiste por completo en RNA. El RNA aparece en gris, la proteína en dorado y el sitio activo se reconoce por la unión de un inhibidor (en verde). (Cortesía de Thomas A. Steitz, Yale University.)

3 FIGURA 11-1 Experimento de Beadle-Tatum para la separación de mutantes genéticos en Neurospora.
Las esporas se radiaron para inducir mutaciones (paso 1) y se permitió que las colonias crecieran en tubos con medios complementados (paso 2). Después se probó la capacidad de las esporas individuales producidas por las colonias para crecer en un medio mínimo (paso 3). Aquellas que no crecieron eran mutantes y la tarea consistía en identificar al gen mutante. En el ejemplo mostrado en el paso 4 se encontró que una muestra de las células mutantes crecía en el medio mínimo complementado con vitaminas, pero no en el medio complementado con aminoácidos. Esta observación señala una deficiencia en una enzima que ayuda a la formación de una vitamina. En el paso 5, el crecimiento de estas mismas células en un medio mínimo complementado con una u otra de las vitaminas indica que la deficiencia reside en un gen que participa en la formación del ácido pantoténico (parte de la coenzima A).

4 FIGURA 11-2 Revisión del flujo de información en una célula eucariota.
El DNA de los cromosomas localizados dentro del núcleo contiene toda la información genética almacenada. Los sitios seleccionados del DNA se transcriben en pre-mRNA (paso 1) y se procesan en mRNA (paso 2). Los mRNA se desplazan fuera del núcleo (paso 3) hacia el citoplasma, donde los ribosomas que se mueven a lo largo del mRNA (paso 4) los traducen en polipéptidos. Después de la traducción, el polipéptido se pliega para adquirir su conformación original (paso 5).

5 FIGURA 11-3 Estructura bidimensional de un RNA ribosómico bacteriano
FIGURA Estructura bidimensional de un RNA ribosómico bacteriano que muestra la extensa complementariedad de bases entre regiones diferentes de la cadena sencilla. La sección amplificada evidencia la secuencia de bases de un tallo y asa, incluidos un apareamiento de bases no convencional (G-U) y un nucleótido modificado, la metiladenosina. Una de las hélices aparece con diferente sombreado porque tiene una participación esencial en la función del ribosoma, como se revisa en la página 463. En la figura 11-43b se muestra un ejemplo de la estructura tridimensional de un RNA. FIGURA 11-3 Estructura bidimensional de un RNA ribosómico bacteriano

6 FIGURA 11-4 Alargamiento de la cadena durante la transcripción.
(b) FIGURA Alargamiento de la cadena durante la transcripción. (a) Modelo esquemático del alargamiento de una molécula de RNA recién sintetizada durante la transcripción. La polimerasa cubre alrededor de 35 pares de bases del DNA, la burbuja de transcripción compuesta de DNA de cadena sencilla (separada) contiene cerca de 15 pares de bases y el segmento presente en un híbrido DNA-RNA incluye más o menos nueve pares de bases. La enzima crea un superenrollamiento (superenrollamiento positivo) de DNA por delante de éste y un desenrollamiento (superenrollamiento negativo) de DNA por detrás (pág. 391). (b) Modelo esquemático de una RNA polimerasa en el momento de la elongación de la transcripción. El DNA en dirección 3' permanece en un surco dentro de la polimerasa, sujeto por un par de mandíbulas formadas por las dos subunidades principales de la enzima. El DNA traza una vuelta pronunciada en la región del sitio activo, por lo que el DNA en dirección 5' se extiende en la parte superior de este dibujo. El RNA naciente sale del sitio activo de la enzima a través de un conducto separado. (Continúa…)

7 FIGURA 11-4 Alargamiento de la cadena durante la transcripción
FIGURA Alargamiento de la cadena durante la transcripción. (Continuación) … (c) El alargamiento de la cadena ocurre como resultado de un ataque por el 3'OH del nucleótido en el extremo de la cadena en crecimiento sobre el 5'α-fosfato del trifosfato de nucleósido que se integra. El pirofosfato liberado después se corta y ello dirige la reacción hacia la polimerización. La geometría entre el pareamiento de bases entre el nucleótido de la cadena plantilla y el nucleótido que se integra determina cuál de los cuatro posibles trifosfatos de nucleósidos se incorpora en la cadena creciente de RNA en cada sitio. (d) Micrografía electrónica de varias moléculas de RNA polimerasa unidas a una plantilla de DNA de un fago. (d: por cortesía de Robley C. Williams.) (c) (d)

8 FIGURA Ejemplos de técnicas experimentales para rastrear la actividad de una sola molécula de RNA polimerasa. (a) En este protocolo, la molécula de RNA polimerasa está firmemente unida al portaobjetos y se permite que transcriba una molécula de DNA que contiene una esfera fluorescente en el extremo terminal en dirección 5'. Las flechas indican el movimiento del DNA a través de la polimerasa. La velocidad del movimiento y el progreso de la polimerasa pueden rastrearse al observar la posición de la esfera en el tiempo, para lo cual se emplea un microscopio fluorescente. (b) En este protocolo, la polimerasa unida transcribe una molécula de DNA con una esfera en su extremo terminal en dirección 3'. Como en a, las flechas indican la dirección del movimiento del DNA. La esfera queda atrapada en una trampa óptica (rayo láser), la cual ejerce una fuerza conocida que puede regularse al ajustar el rayo láser. Este tipo de aparato puede medir las fuerzas generadas por una polimerasa activa en transcripción. (Reimpresa de J. Gelles y R. Landick, Cell 93:15, 1998, © 1998, con autorización de Elsevier Science.) (a) (b)

9 (a) FIGURA Representación esquemática del inicio de la transcripción en bacterias. (a) En ausencia del factor σ, la enzima central no interactúa con el DNA en los sitios de iniciación específicos. (b-d) Cuando la enzima central se relaciona con el factor σ, la enzima completa (u holoenzima) es capaz de reconocer y unirse con regiones promotoras del DNA, separar las cadenas de la doble hélice de DNA e iniciar la transcripción en los sitios de inicio adecuados (fig. 11-7). En el modelo tradicional mostrado aquí, el factor σ se disocia de la enzima central, capaz de alargar la transcripción. Estudios recientes sugieren que al menos en algunos casos, σ puede permanecer con la polimerasa. (b) (c) (d)

10 FIGURA 11-7 Elementos básicos de una región promotora en el DNA de la bacteria E. coli.
Las secuencias clave de regulación necesarias para el inicio de la transcripción se encuentran en las regiones localizadas a −35 y −10 pares de bases del sitio en el cual comienza la transcripción. El sitio de inicio marca el límite entre los lados + y − del gen.

11 (a) (b) FIGURA Comparación de la estructura de la RNA polimerasa procariota y eucariota. (a) RNA polimerasas de los tres dominios de vida. Cada subunidad de una enzima está indicada por un color diferente y es etiquetada de acuerdo con la nomenclatura convencional para esa enzima. Las subunidades homólogas se muestran del mismo color. Puede verse que las polimerasas de las arqueobacterias y los eucariotas tienen estructura más parecida que las enzimas bacterianas y la eucariota. La RNA polimerasa II (mostrada aquí) es una de las tres principales RNA polimerasas nucleares eucariotas. (b) Diagrama tipo listón de la estructura central de la RNA polimerasa II de la levadura. Las regiones de la polimerasa bacteriana que tienen homología estructural con la enzima de la levadura se presentan en color verde. Es evidente el conducto grande que sujeta el DNA distal. El metal divalente situado en el extremo del conducto y dentro del sitio activo se ve como una esfera roja. (a: tomada de Akira Hirata, Brianna J. Klein y Katsuhiko S. Murakami. Nature 451:852, 2008, © copyright 2008, Macmillan Magazines Ltd. b: tomada de Patrick Cramer, David A. Bushnell y Roger D. Kornberg, Science 292:1874, 2001; © copyright 2001, American Association for the Advancement of Science.)

12 FIGURA 11-9 Composición macromolecular del ribosoma de un mamífero.
Este esquema muestra los componentes presentes en cada una de las subunidades de un ribosoma de mamífero. La síntesis y procesamiento de los rRNA y el ensamble de las subunidades ribosómicas se revisan en las páginas siguientes. (Tomada de D. P. Snustad et al., Principles of genetics. © 1997 John Wiley & Sons, Inc. Reimpresa con autorización de John Wiley & Sons, Inc.)

13 (a) (b) FIGURA 11-10 El nucléolo.
(a) Micrografía óptica de dos células humanas de HeLa transfectadas con un gen que codifica a una proteína ribosómica fusionada a la proteína fluorescente verde (GFP). La proteína ribosómica fluorescente puede observarse en el citoplasma, donde se sintetiza y realiza su función, y en el nucléolo (flechas blancas), donde se ensambla para formar los ribosomas. (b) Micrografía electrónica de una sección que muestra parte de un núcleo con el nucléolo. Se distinguen tres regiones morfológicas en el nucléolo. La parte principal del nucléolo consiste en un componente granular (gc). Embebidos dentro de los gránulos se hallan los centros fibrilares (fc) que están rodeados por componentes fibrilares más densos (dfc). El recuadro muestra un dibujo esquemático de estas partes del nucléolo. De acuerdo con un modelo, el fc contiene el DNA que codifica al RNA ribosómico y el dfc contiene la transcripción del pre-rRNA emergente y proteínas relacionadas. Según este modelo, la transcripción del precursor del pre-rRNA se realiza en la frontera entre el fc y el dfc. (Nota: los nucléolos tienen otras funciones no relacionadas con la biogénesis de los ribosomas que no se consideran en este texto.) La barra tiene un diámetro de 1 μm. (a: tomada de C.E. Lyon y A. I. Lamond, Curr. Biol. 10:R323, 2000; b: tomada de Pavel Hozak et al., J. Cell Science 107:641, 1994; con autorización de the Company of Biologists, Ltd.)

14 FIGURA 11-11 Síntesis del RNA ribosómico.
(a) Micrografía óptica de un núcleo aislado de oocito de Xenopus teñido que revela cientos de nucléolos. (b) Micrografía electrónica de un segmento de DNA aislado de un nucléolo del oocito del Xenopus. El DNA (llamado rDNA) contiene los genes que codifican a los dos RNA ribosómicos grandes, los cuales se forman a partir de una sola transcripción primaria. Numerosos genes se muestran aquí, cada uno en el proceso de la transcripción. Ésta se reconoce por la estructura fibrilar unida al DNA. Dichas fibras consisten en RNA naciente y proteínas relacionadas. Los segmentos de DNA entre los genes que se someten a transcripción son fragmentos que no se transcriben. Las flechas indican sitios donde se inicia la transcripción. (Continúa…)

15 FIGURA 11-11 Síntesis del RNA ribosómico. (Continuación)
… (c) Vista cercana de dos genes nucleolares sujetos a transcripción. La longitud de la transcripción primaria del rRNA emergente se incrementa conforme la distancia aumenta desde el punto de inicio. Las moléculas de la RNA polimerasa de la base de cada fibrilla pueden observarse como puntos. (a: tomada de Donald D. Brown e Igor B. Dawid, Science 160:272, 1968; © 1968 American Association for the Advancement of Science. b-c: cortesía de Oscar L. Miller, Jr., y Barbara R. Beatty.) (c)

16 FIGURA 11-12 Unidad de transcripción del rRNA.
El dibujo de la parte superior muestra la apariencia de una porción del DNA de un nucléolo, el cual transcribe un rRNA. La representación de abajo ilustra una de las unidades de transcripción que codifica al rRNA en Xenopus y ratones. Estas partes del DNA que codifican a los productos de rRNA maduros aparecen en azul. Las regiones del espacio transcrito, esto es, áreas del DNA que se transcriben pero cuyos RNA correspondientes se degradan durante el procesamiento, se muestran en amarillo. El espaciador no transcrito, que permanece entre las unidades de transcripción, contiene las regiones promotoras en el extremo 5' del gen. (Según B. Sollner-Webb y E. B. Mougey, Trends Biochem. Sci. 16:59, 1991.)

17 FIGURA 11-13 Análisis cinético de la síntesis y procesamiento del rRNA.
Un cultivo de células de mamífero se incubó durante 10 min en [14C]metionina y luego se cambió a un medio no marcado en diferentes tiempos, como se indica en cada panel. Después del cambio, las células se lavaron para dejarlas libres del isótopo, se homogeneizaron y se prepararon fracciones citoplásmicas y nucleolares. El RNA de cada fracción se extrajo y se analizó por medio de sedimentación en gradiente de densidad de sacarosa. Como se revisa en la sección 18.10, esta técnica separa a los RNA de acuerdo con su tamaño (los grandes son los más próximos a la parte inferior del tubo, el cual corresponde a la fracción 1). La línea continua representa la absorbancia ultravioleta de cada fracción celular, la cual provee una medida de la cantidad de RNA de cada clase de acuerdo con su tamaño. Este perfil de absorbancia no cambia con el tiempo. La línea punteada se refiere a la radiactividad en diferentes momentos durante el cambio. Las gráficas del RNA nucleolar (perfiles superiores) muestran la síntesis de los precursores de rRNA 45S y su conversión subsecuente a la molécula 32S, que es un precursor de los rRNA 28S y 5.8S. Los otros productos principales del precursor 45S dejan el núcleo con rapidez y de esta forma no aparecen de manera importante en el RNA nucleolar. Los perfiles inferiores señalan el tiempo de la aparición de las moléculas de rRNA maduro en el citoplasma. Los rRNA 18S aparecen en el citoplasma antes de la aparición de las especies más grandes 28S, que se correlacionan con el rápido éxodo de aquellos desde el nucléolo. (Tomada de H. Greenberg y S. Penman, J. Mol. Biol. 21:531, 1966; © 1966, con autorización de the publisher Academic Press.)

18 FIGURA 11-14 Esquema propuesto para el procesamiento del RNA ribosómico de mamíferos.
La transcripción primaria para el rRNA es una molécula 45S de unas bases. Los cortes principales durante el procesamiento de este pre-rRNA se indican por medio de los números encerrados en círculos. El corte de la transcripción primaria en los sitios 1 y 5 elimina las secuencias transcritas externas 5' y 3' y produce un intermediario 41S. El segundo corte puede ocurrir en los sitios 2 o 3 según sea el tipo de célula. El corte en el sitio 3 genera el intermediario 32S visto en las curvas de la figura anterior. Durante los pasos finales del procesamiento, las secciones 28S y 5.8S se separan y los extremos de diferentes intermediarios se procesan a su tamaño maduro final. (Tomada de R. P. Perry, J. Cell Biol. 91:29S, 1981; con autorización de la Rockefeller University Press.)

19 FIGURA 11-15 Modificación del pre-rRNA.
( a) Las modificaciones más frecuentes de los nucleótidos en un pre-rRNA son la conversión de una uridina a una seudouridina y la metilación de una ribosa en el sitio 2' del azúcar. Para convertir uridina a seudouridina se rompe el enlace N1⎯C1' y el anillo de uracilo se rota 180o, el cual coloca al C5 del anillo en posición para formar un nuevo enlace con C1' de la ribosa. Se piensa que componentes de una proteína del snoRNP catalizan estas modificaciones químicas, pero las enzimas aún no se identifican. (Continúa…) (a)

20 FIGURA 11-15 Modificación del pre-rRNA.. (Continuación)
… (b) Formación de un dúplex RNA-RNA entre snoRNA U20 y una porción del pre-rRNA que genera la metilación de 2' ribosa. En cada caso, el nucleótido metilado en el rRNA se une mediante un puente de hidrógeno a un nucleótido del snoRNA localizado a cinco pares de bases de la caja D. Esta última, que contiene la secuencia invariable CUGA, está presente en todos los snoRNA que guían la metilación de la ribosa. (c) Formación de un dúplex RNA-RNA entre snoRNA U68 y una porción del pre-rRNA que lleva a la conversión de una uridina en seudouridina (ψ). La seudouridilación tiene lugar en un sitio relativamente fijo para un plegamiento en forma de asa en el snoRNA. Los snoRNA que controlan la seudouridilación poseen una secuencia ACA 3' compartida. (b: según J. P. Bachellerie y J. Cavaillé, Trends in Bioch. Sci. 22:258, 1997; © 1997, con autorización de Elsevier Science; c: según P. Ganot et al., Cell 89:802, 1997.) (b) (c)

21 FIGURA 11-16 El ordenamiento de genes que codifican a los RNA de transferencia en Xenopus.
El fragmento de DNA de 3.18 kilobases muestra el ordenamiento de diferentes genes de tRNA y sus espaciadores. (Tomada de S. G. Clarkson et al., en D. D. Brown, ed., Developmental Biology Using Purified Genes, Academic Press, 1981.)

22 (a) (b) FIGURA Formación del RNA nuclear heterogeneo (hnRNA) y su conversión a mRNA mas pequeños. (a) Las curvas muestran el patrón de sedimentación del RNA total extraído de células sanguíneas de pato después de la exposición a [32P]fosfato por 30 min. Los RNA más grandes viajan mucho más durante la centrifugación y más cerca de la región inferior del tubo donde yacen. La absorbancia (línea azul) indica la cantidad total de RNA en diferentes regiones del tubo de centrifugación, mientras que las líneas rojas señalan la radiactividad correspondiente. Es evidente que la mayor parte de los RNA sintetizados de novo es muy grande, más que los rRNA estables 18S y 28S. Estos RNA grandes son los hnRNA. (b) La absorbancia y los perfiles de radiactividad del RNA se extrajeron de células marcadas por pulsos durante 30 min como en la parte a, pero después se continuaron por 3 h en presencia de actinomicina D, que previene la síntesis del RNA adicional. Es evidente que los hnRNA grandes se han procesado en productos de RNA más pequeños. (Tomada de G. Attardi et al., J. Mol. Biol. 20:160, © 1966, con autorización de the publisher Academic Press.)

23 (a) FIGURA Inicio de la transcripción a partir de un promotor para la polimerasa II eucariota. (a) Secuencia nucleotídica de la región en dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción en tres genes eucarióticos diferentes. La caja TATA se indica por el cuadro sombreado en azul. Muchos promotores eucariotas contienen un segundo elemento promotor conservado llamado iniciador (Inr), que incluye el sitio donde comienza la transcripción (se muestra en naranja). Otros elementos promotores se muestran en la figura Hay que señalar que 1) la mayoría de los promotores eucariotas carecen de caja TATA reconocible y 2) se han identificado muchos otros elementos promotores, como el DPE mostrado en la parte b, que se encuentran en dirección 3' al sitio de inicio de la transcripción. Diferentes genes contienen combinaciones distintas de elementos promotores, por lo que sólo se necesita un subgrupo para la nucleación del ensamble PIC. (Continúa…)

24 FIGURA Inicio de la transcripción a partir de un promotor para la polimerasa II eucariota. (Continuación) … (b) Un modelo muy esquemático de los pasos en el ensamblaje del complejo de pre-inicio de la RNA polimerasa II. La polimerasa se refiere como RNAPII; los otros componentes son los factores transcripcionales generales necesarios en el ensamble del complejo en su totalidad. El TFIID incluye una subunidad TBP, que se une de manera específica a la caja TATA y otras subunidades diferentes, que en su conjunto se conocen como factores relacionados con TBP (TAF). Al parecer, TFIIB provee un sitio de unión para la RNA polimerasa. TFIIF contiene una subunidad homóloga con el factor bacteriano σ el cual se une a la polimerasa entrante. TFIIH contiene nueve subunidades, tres de las cuales poseen actividades enzimáticas. (b)

25 (a) (b) FIGURA Modelos estructurales de la formación del complejo de preinicio. (a) Modelo del complejo formado por el DNA y tres de los GTF, TBP de TFIID, TFIIA y TFIIB. La interacción entre la caja TATA y el TBP dobla al DNA cerca de 80° y permite que el TFIIB se una al DNA en direcciones 5' y 3' de la caja TATA. (b) Vistas superior e inferior de un modelo del complejo de preinicio. A diferencia del modelo esquemático de la figura 11-18b, el DNA (que se muestra en blanco) se enrolla al parecer alrededor del complejo de preinicio de tal forma que los GTF pueden tener contacto con el DNA en ambos lados del sitio de inicio de la transcripción. (a: tomada de Gourisankar Ghosh y Gregory D. Van Duyne, Structure 4:893, 1996; b: tomada de M. Douziech et al., Mol. Cell Biol. 20:8175, 2000; cortesía de Benoit Coulombe.)

26 FIGURA La iniciación de la transcripción por RNA polimerasa II se acompaña de fosforilación del dominio terminal C (CTD). La iniciación de la transcripción se relaciona con la fosforilación catalizada por TFIIH de los residuos de serina en la posición 5 de cada repetición de siete elementos del CTD. Se cree que la fosforilación desencadena la separación entre la maquinaria de transcripción y los factores generales de transcripción del DNA promotor o ambos. El escape del promotor se acompaña de cambios mayores en la conformación de la polimerasa, la cual se convierte de una enzima que “tiene problemas” para sintetizar RNA en una que es muy procesiva. SII, ELL y P-TEFb son tres de varios factores de elongación que pueden relacionarse con la polimerasa conforme se desplaza por el DNA. SII ayuda a la polimerasa a moverse de nuevo después de una pausa, mientras que P-TEFb es una cinasa que fosforila los residuos de serina #2 del CTD después que comienza la elongación. Se cree que la fosforilación de los residuos #2 de serina fomenta el reclutamiento de factores para corte y empalme de RNA y factores de poliadenilación, cuyas actividades se describen en las secciones siguientes (fig ).

27 FIGURA 11-21 Estructura del mRNA de la globina 𝛃 humana.
El mRNA contiene un casquete de metilguanosina 5', regiones 5' y 3' no codificantes que flanquean al segmento codificante y una cola de poli(A) 3'. La longitud de cada segmento se refiere a varios nucleótidos. La longitud de la cola de poli(A) es variable. Casi siempre comienza con una longitud cercana a 250 nucleótidos y se acorta en forma gradual, como se explica en la página 526. Se muestra la estructura del capuchón 5'.

28 FIGURA 11-22 Diferencia de tamaño entre los hnRNA y los mRNA.
(a,b) Micrografías electrónicas de preparaciones sombreadas con polvo de metal de moléculas de poli(A)-mRNA (a) y poli(A)-hnRNA (b). Aquí se muestran los tamaños representativos de cada tipo. La molécula de referencia es un DNA viral de ϕX-174. (Continúa…) (b)

29 FIGURA 11-22 Diferencia de tamaño entre los hnRNA y los mRNA
FIGURA Diferencia de tamaño entre los hnRNA y los mRNA. (Continuación) … (c) Distribuciones en tamaño del hnRNA y el mRNA de células L de ratón que se determinan por sedimentación en gradiente de densidad. La línea roja representa el hnRNA que se marca con suma rapidez, mientras que la línea púrpura representa el mRNA aislado de polirribosomas después de un periodo de 4 h de marcaje. Las abscisas se han convertido de una fracción de número (indicado por los puntos) al tamaño molecular por calibración de los gradientes. (Tomada de John A. Bantle y William E. Hahn, Cell 8:145, 1976; con autorización de Cell Press.) (c)

30 FIGURA 11-23 Descubrimiento de las secuencias interpuestas (intrones).
Una porción del genoma del adenovirus se muestra en la parte superior. Las secuencias discontinuas de los bloques marcados con x, y y z aparecen en un ordenamiento continuo en el mRNA maduro que codifica a diferentes polipéptidos como la proteína hexón. Como se revisa más adelante, la conversión de la transcripción primaria a mRNA supone la eliminación (escisión) de las secuencias interpuestas o intrones (I1 a I 3) y la ligación de las porciones remanentes para producir una molécula continua de RNA (parte inferior). En la figura se muestran los pasos por medio de los cuales ocurre esto.

31 FIGURA 11-24 Descubrimiento de los intrones en un gen eucariota.
Como se analiza en el capítulo 18, las bacterias tienen enzimas de restricción que reconocen y cortan las moléculas de DNA en un sitio de ciertas secuencias nucleotídicas. El dibujo muestra un mapa de sitios de restricción de enzimas de corte en la región del gen de la globina β de conejo (parte superior) y el mapa correspondiente de un cDNA preparado a partir del mRNA de la globina β (inferior). (Un cDNA es un DNA conformado in vitro a través de la enzima transcriptasa inversa mediante un mRNA usado como plantilla. De esta forma, el cDNA tiene la secuencia complementaria del mRNA. El cDNA se ha utilizado para este experimento porque las enzimas de restricción no cortan los RNA.) Las letras indican los sitios en los cuales diferentes enzimas de restricción cortan los dos DNA. El mapa superior muestra que el gen de la globina contiene un sitio de restricción para la enzima BamH1 (B) localizada unos 700 pares de bases desde un sitio de restricción para la enzima EcoR1 (E). Cuando el cDNA de la globina se trató con estas mismas enzimas (mapa inferior), los sitios correspondientes B y E estuvieron separados sólo por 67 nucleótidos. Es evidente que el DNA preparado a partir del genoma tiene una región que está ausente del cDNA correspondiente (y por lo tanto está ausente del mRNA a partir del cual se generó el cDNA). La secuencia completa del gen de la globina que se muestra después contiene un segundo intrón más pequeño. (Tomada de A. J. Jeffreys y R. A. Flavell, Cell 12:1103, 1977; con autorización de Cell Press.)

32 FIGURA 11-25 Visualización de un intrón en el gen de la globina.
Micrografía electrónica de híbridos formados entre (a) el RNA precursor de la globina 15S y el DNA de un gen de la globina, y (Continúa…)

33 (b) (b) FIGURA Visualización de un intrón en el gen de la globina. (Continuación) … (b) el mRNA de la globina 10S y el mismo DNA como se muestra en a. Las líneas rojas punteadas indican las posiciones de las moléculas de RNA. El precursor de RNA es equivalente en longitud y secuencia al DNA del gen de la globina, pero al mRNA 10S le falta una porción que está presente en el DNA del gen. Estos resultados sugieren que el RNA 15S se procesa al eliminar una secuencia interna de RNA y otra vez al unir las regiones flanqueadoras. (Tomada de Shirley M. Tilghman et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 75:1312, 1978.)

34 FIGURA 11-26 Visualización de los intrones en el gen de la ovoalbumina.
Micrografía electrónica de un híbrido formado entre el mRNA de la ovoalbúmina y un fragmento del DNA genómico de pollo que contiene el gen de la ovoalbúmina. El híbrido que se muestra en esta micrografía es similar en naturaleza al de la figura 11-25b. En ambos casos, el DNA contiene la secuencia entera del gen porque se aisló directamente del genoma. En cambio, el RNA se ha procesado por completo y las porciones que se transcribieron de los intrones se removieron. Cuando el DNA genómico y el mRNA se hibridan, las porciones del DNA que no están representadas en el mRNA forman asas. En esta figura se pueden observar las asas de siete intrones (A-G). (Cortesía de Pierre Chambon.)

35 FIGURA Las transcripciones del pre-mRNA se procesan conforme se sintetizan (esto es, en sentido cotranscripcional). ( a) Micrografía electrónica de una unidad de transcripción no ribosómica que muestra la presencia de partículas de ribonucleoproteínas unidas a las transcripciones del RNA naciente. (b) Dibujo que trata de interpretar la micrografía que se muestra en la parte a. La línea punteada representa la tira de cromatina (DNA), las líneas sólidas las fibrillas de ribonucleoproteína (RNP) y los círculos sólidos las partículas RNP relacionadas con las fibrillas. Para numerar las transcripciones individuales, se empieza con el más cercano al punto de inicio. Las partículas RNP no se distribuyen de modo aleatorio a lo largo de la transcripción emergente, sino que se unen a sitios específicos donde se realiza el procesamiento del RNA. (Tomada de Ann L. Beyer, Oscar L. Miller, Jr., y Steven L. McKnight, Cell 20:78, 1980; con autorización de Cell Press.) (a) (b)

36 FIGURA Pasos en la adicion de un capuchon de metilguanosina 5' y una cola de poli(A) en el extremo 3' de un pre-mRNA. El extremo 5' de un pre-mRNA naciente se une a una enzima de capuchón, la cual en los mamíferos, tiene dos sitios activos que catalizan reacciones diferentes: una trifosfatasa que remueve al grupo fosfato terminal (paso 1) y una transferasa de guanililo que adiciona un residuo de guanina en orientación inversa, por medio de un enlace 5'-a-5' (paso 2). En el paso 3, diferentes transferasas de metilo agregan un grupo metilo al capuchón de guanosina terminal y la ribosa del nucleótido colocado en el extremo del RNA emergente. Un complejo proteínico (llamado CBC) se une al capuchón (no se muestra). Una serie de sucesos muy diferentes ocurre en el extremo 3' del pre-mRNA, donde un complejo grande de proteínas se ensambla. Primero, una endonucleasa divide el transcrito de RNA primario, lo que genera un nuevo extremo 3' proximal al extremo 3' original. En los pasos a-c, una polimerasa de poli(A) añade residuos de adenosina al extremo 3' sin intervención de una plantilla de DNA. Un mRNA característico de mamífero contiene 200 a 250 residuos de adenosina en su cola completa de poli(A); el número es considerablemente menor en eucariotas inferiores. (Según D. A. Micklos y G. A. Freyer, DNA Science, Carolina Biological Supply Co.)

37 FIGURA 11-29 Sinopsis de los pasos durante el procesamiento del mRNA de la globina.
Los intrones se muestran en púrpura, mientras que las porciones azul oscuro del gen aluden a las posiciones de los exones, que son las secuencias de DNA representadas en el mRNA maduro

38 FIGURA 11-30 Secuencias nucleotidicas en los sitios de corte y empalme del pre-mRNA.
Además de codificar la información para construir un polipéptido, un pre-mRNA también debe contener información que dirija la maquinaria encargada del corte y empalme del RNA. Las secuencias nucleotídicas mostradas en las regiones de los sitios de corte y empalme están basadas en el análisis de un gran número de pre-mRNA y por tanto se refieren como secuencias de consenso. Las bases que se muestran en naranja virtualmente no varían y las que aparecen en negro representan las bases preferidas en estas posiciones. N representa cualquiera de los cuatro nucleótidos mientras que la Y es una pirimidina. La secuencia de polipirimidina cercana al sitio de corte y empalme 3' casi siempre contiene entre 10 y 20 pirimidinas.

39 FIGURA 11-31 Estructura y la vía de autocorte y empalme de los intrones del grupo II.
(a) Estructura bidimensional de un intrón del grupo II (mostrado en rojo). El intrón se pliega en seis dominios característicos que irradian de una estructura central. Los asteriscos indican los nucleótidos de adenosina que se abultan fuera del dominio VI y forman una estructura semejante a una soga descrita en el texto. Los dos extremos del intrón llegan a estar muy cercanos entre sí, como lo indica la proximidad de los dos enlaces intrón-exón. (Continúa…) (a)

40 FIGURA 11-31 Estructura y la vía de autocorte y empalme de los intrones del grupo II. (Continuación)
… (b) Pasos en el autocorte y empalme de los intrones del grupo II. En el paso 1, el OH 2' de una adenosina dentro del intrón (asterisco en el dominio VI de la parte A) realiza un ataque nucleofílico al sitio de corte y empalme 5', que corta el RNA y forma un enlace fosfodiéster 2'-5' raro con el primer nucleótido del intrón. Esta estructura ramificada se describe como una soga. En el paso 2, el grupo OH 3' libre del exón desplazado ataca al sitio de corte y empalme 3', el cual corta el RNA en el otro extremo del intrón. Como resultado de esta reacción, el intrón se libera en la forma de una soga y los extremos 3' y 5' de los dos exones flanqueadores se ligan (paso 3). Una vía similar se sigue en el corte y empalme de intrones de los pre-mRNA, pero en lugar de suceder por autocorte y empalme, estos pasos requieren la ayuda de distintos factores adicionales. (b)

41 FIGURA Modelo esquemático del ensamble de la maquinaria de corte y empalme y algunos de los pasos que ocurren durante este proceso. El paso 1 muestra la porcion del pre-mRNA que se somete a corte y empalme. En el paso 2, el primero de los componentes del corte y empalme, U1 snRNP, se ha unido al sitio 5' del corte y empalme del intrón. La secuencia nucleotídica del snRNA U1 es complementaria del sitio de corte y empalme 5' del premRNA y hay evidencias que indican que el snRNP U1 se une de manera inicial al extremo 5' del intrón por la formación de pares de bases específicas entre el sitio de corte y empalme y el snRNA U1 (véase recuadro A). El sn RNP U2 es el siguiente en entrar al complejo de corte y empalme y se une al pre-mRNA (como se muestra en el recuadro A), lo cual ocasiona que un residuo de adenosina específico (resaltado) se exponga hacia afuera de la hélice (paso 3). (Continúa)

42 FIGURA Modelo esquemático del ensamble de la maquinaria de corte y empalme y algunos de los pasos que ocurren durante este proceso. (Continuación) … Éste es el sitio que más tarde será un punto de bifurcación de la soga. Se piensa que al U2 lo recluta la proteína U2AF, que se une a la secuencia de polipirimidina cerca del sitio de corte y empalme 3'. U2AF también interacciona con las proteínas SR que se unen a los aumentadores exónicos de corte y empalme (ESE). Estas interacciones tienen una función importante en el reconocimiento de los extremos intrón/exón. El próximo paso es la unión de los snRNP U4/U6 y U5 al premRNA con el desplazamiento de U1 (paso 4). El ensamble de un empalmosoma implica una serie de interacciones dinámicas entre el pre-mRNA y los snRNA específicos y entre los snRNA mismos. A medida que entran en el complejo con el pre-mRNA, los snRNA U4 y U6 se parean de manera extensa el uno con el otro (recuadro B). El snRNA U4 se separa después del dúplex y las regiones de U6 que estaban apareadas con U4 se parean con una porción de los snRNA U2 (recuadro C). Otra porción del snRNA U6 se halla en el sitio de corte y empalme 5' (recuadro C) y ha desplazado al snRNA U1 que antes estaba unido ahí (recuadro A). Se propuso que U6 es una ribozima y que U4 es un inhibidor de su actividad catalítica. Según esta hipótesis, una vez que los snRNA U1 y U4 se desplazan, el snRNA U6 está en posición para catalizar las dos reacciones químicas necesarias para retirar el intrón. Según una visión alternativa, las reacciones son catalizadas por la actividad combinada del snRNA U6 y una proteína de la snRNP U5. Cualquiera que sea el mecanismo, la primera reacción (indicada con la flecha en inserto C) conduce a la separación del sitio de corte y empalme 5', lo que forma un exón 5' libre y un intermediario intrón lazo-exón 3' (paso 5). Se piensa que la porción 5' libre del exón se coloca en el lugar por su relación con el snRNA U5 del empalmosoma, que también interactúa con el sitio de corte y empalme 3' (paso 5). A la primera reacción de corte en el sitio de corte y empalme 5' le sigue una segunda reacción de corte en el sitio de corte y empalme 3' para eliminar el intrón en forma de soga y de manera simultánea unir los extremos de los dos exones vecinos (paso 6). Después del corte y empalme, los snRNP deben liberarse del pre-mRNA, reiniciarse las relaciones originales entre los snRNA y reensamblarse los snRNP en los sitios de otros intrones.

43 FIGURA 11-33 La estructura de un snRNP.
(b) (a) FIGURA La estructura de un snRNP. (a) Modelo de una partícula snRNP U1 basada en datos bioquímicos e información estructural obtenida a partir de microscopia crioelectrónica. En el núcleo de la partícula se halla un complejo proteínico en forma de anillo compuesto de siete proteínas Sm diferentes y comunes en todos los snRNP U. Otras tres proteínas son únicas de los snRNP U1 (llamadas 70K, U1-A y U1-C). Los brazos I, II y IV son partes de los snRNA U1 de 165 bases. El snRNA se ensambla en el citoplasma y se importa al núcleo, donde realiza su función. (b) Modelo de un snRNA U1 casi en la misma orientación que en a. (Reimpresa con autorización de Holger Stark et al., Nature 409:541, 2001; © 2001 Macmillan Magazines Limited.)

44 (a) (b) FIGURA Similitudes estructurales propuestas entre las reacciones de corte y empalme realizadas por el empalmosoma en los pre-mRNA y las reacciones de auto-corte y empalme de los intrones del grupo II. (a) Interacciones entre un intrón de una molécula de premRNA (flanqueada por los exones 1 y 2) y dos snRNA (U2 y U6) que se requieren para el corte y empalme. (b) La estructura de un intrón del grupo II muestra un ordenamiento de las partes críticas que se alinean durante el auto-corte y empalme (como se indica en la figura 11-31). La semejanza de las partes del intrón del grupo II con los RNA combinados en la parte a es evidente. Los residuos que no varían se muestran en letras mayúsculas; las purinas y las pirimidinas conservadas se expresan por r e y, respectivamente. Los residuos variables se muestran con una n. (Según A. M. Weiner, Cell 72:162, 1993; con autorización de Cell Press.)

45 FIGURA Representación esquemática de un mecanismo para la coordinación de la transcripcion, colocación de capuchon, poliadenilacion y corte y empalme. En este modelo simplificado, el dominio C-terminal (CTD) de la subunidad grande de la RNA polimerasa (pág. 436) sirve como andamiaje flexible para la organización de los factores participantes en el procesamiento pre-mRNA, incluidos los de la colocación de capuchón, poliadenilación y eliminación de intrón. Además de las proteínas mostradas aquí, es probable que la polimerasa se relacione con muchos factores de transcripción, así como enzimas que modifican la plantilla de cromatina. Las proteínas unidas con la polimerasa en cualquier momento particular podrían depender de los residuos de serina del CTD que estén fosforilados. El patrón de residuos de serina fosforilados cambia conforme la polimerasa avanza del principio al final del gen que se transcribe (comparar con fig ). Los grupos fosfato unidos con los residuos #5 se perdieron casi para cuando la polimerasa transcribe el extremo 3' del RNA. (Tomada de E. J. Steinmetz, Cell 89:493, 1997, con autorización de Cell Press.)

46 FIGURA 11-36 Procesamiento del pre-mRNA de ovomucoide.
L a fotografía muestra un método conocido como Northern blot, en el cual el RNA extraído (en este caso del núcleo de células del oviducto de gallina) se fracciona por electroforesis en gel y se transfiere a un filtro membranal. El RNA inmovilizado en el filtro se incuba con un cDNA marcado con radiactividad (en este caso un cDNA elaborado a partir del mRNA ovomucoide) para producir bandas que identifiquen la posición de los RNA que contienen la secuencia complementaria. El mRNA maduro que codifica a la proteína ovomucoide posee una longitud de nucleótidos y se muestra en la parte inferior del ensayo. Es evidente que el núcleo contiene varios RNA más largos que también tienen la secuencia nucleotídica del mRNA ovomucoide. El RNA más largo en el ensayo posee una longitud de nucleótidos y corresponde al tamaño de la unidad de transcripción ovomucoide; se presume que este RNA es la transcripción primaria de la cual se deriva el mRNA. Otras bandas prominentes contienen RNA con longitudes de nucleótidos (que corresponden a una transcripción que perdió los intrones 5 y 6), nucleótidos (una transcripción que perdió los intrones 4, 5, 6 y 7) y nucleótidos (una transcripción que perdió todos los intrones excepto el 3). (Cortesía de Bert O’Malley.)

47 FIGURA 11-37 Interferencia de RNA.
( a) Las petunias normalmente son de color púrpura. Las flores de esta planta son blancas porque las células contienen un gen extra (un transgén) que codifica una enzima necesaria para la producción de color. El gen agregado ocasiona una interferencia de RNA que causa la destrucción específica de mRNA transcrito tanto desde el transgén como de los genes de la propia planta, lo cual hace que las flores sean básicamente despigmentadas. (b) Un nematodo con un gen que codifica una proteína de fusión GFP (pág. 267) expresado de manera específica en la faringe del animal. (c) Este gusano se desarrolló de un progenitor con el mismo genotipo que el mostrado en b, cuyas gónadas se habían inyectado con una solución del dsRNA complementario del mRNA de la proteína bajo estudio. La ausencia de tinción refleja la destrucción del mRNA por un RNA de interferencia. (a: tomada de David Baulcombe, Curr. Biol. 12:R82, 2002; por autorización de Cell Press; b, c: copyright © 2006 New England BioLabs; reimpresa con autorización.) (b) (a) (c)

48 FIGURA 11-38 Formación y mecanismo de acción de los siRNA y miRNA.
(a) En el paso 1, la endonucleasa Dicer corta ambas cadenas de un RNA bicatenario para formar un siRNA pequeño (21 a 23 nucleótidos) que tiene extremos salientes (paso 2). En el paso 3, el siRNA se relaciona con un complejo proteínico, un pre-RISC, que contiene una proteína Argonauta (casi siempre Ago2) capaz de dividir y retirar la cadena pasajera del diRNA doble. En el paso 4, el RNA guía de cadena sencilla, junto con proteínas del complejo RISC, se une con un RNA blanco que tiene secuencia complementaria. El RNA blanco podría ser un RNA viral, un transcrito de un transposón o un mRNA, según las circunstancias. En el paso 5, el RNA blanco se divide en un sitio específico por efecto de la proteína Argonauta y luego se degrada. (Continúa…) (a)

49 FIGURA 11-38 Formación y mecanismo de acción de los siRNA y miRNA
FIGURA Formación y mecanismo de acción de los siRNA y miRNA. (Continuación) … (b) Los microRNA provienen de RNA precursores monocatenarios con secuencias complementarias, lo que les permite plegarse sobre sí mismos para formar un RNA bicatenario con un tallo-asa en un extremo (paso a). Este seudodsRNA (o pri-miRNA) se divide cerca de su asa terminal por acción de un complejo proteínico que contiene una endonucleasa llamada Drosha para generar un pre-miRNA con un extremo 3' colgante de un lado. El pre-miRNA se exporta al citoplasma, donde es dividido por acción de Dicer en un miRNA doble pequeño (paso 2) que tiene un 3' colgante en ambos extremos. El RNA bicatenario se relaciona con un complejo proteínico que contiene una proteína Argonauta (casi siempre Ago1), lo que conduce a la separación de la cadenas y el retiro de la cadena pasajera (llamada miRNA*). Luego, el miRNA de cadena sencilla se une con una región complementaria en un mRNA (paso 4) e inhibe la traducción del mensaje, como se muestra en el paso 5 (o como alternativa, conduce a la desestabilización y degradación del mRNA, como se explica en la sección 12.6). A diferencia de los siRNA, los miRNA que inhiben la traducción sólo son parcialmente complementarios con el mRNA blanco, de ahí el abultamiento. La mayoría de los miRNA vegetales y unos cuantos miRNA animales tienen una secuencia complementaria exacta (o casi exacta) con el mRNA; en estos casos, el resultado de la interacción tiende a ser la división del mRNA de la misma manera que se muestra en a. (También puede señalarse que cierta clase de miRNA proveniente de intrones no forma pri-miRNA en horquilla largos y no requiere Drosha para su procesamiento.) (b)

50 (a) (b) (c) PERSPECTIVA HUMANA FIGURA 1 Los efectos de siRNA en el epitelio intestinal de ratones con enfermedad inflamatoria inducida. (a) Apariencia histológica de un corte en el intestino de un ratón normal. (b) Apariencia del intestino de un ratón con colitis inflamatoria, pero sin tratamiento con siRNA dirigido contra β7. (c) Apariencia del intestino de un ratón que se había tratado con un siRNA dirigido a β7 y diseñado contra un mRNA que codifica la ciclina D1. El siRNA se enfocó en los leucocitos promotores de la inflamación y produjo una reducción drástica en el daño al tejido intestinal. (Tomada de Dan Peer et al., por cortesía de Motomu Shimaoka, Science 319:630, 2008; © copyright 2008, American Association for the Advancement of Science.)

51 FIGURA 11-39 Los microRNA se sintetizan en tejidos específicos durante el desarrollo embrionario.
Estas micrografías de embriones de pez cebra muestran la expresión específica de tres miRNA diferentes cuya localización está indicada por la tinción azul. miR-124a se expresa específicamente en el sistema nervioso (a), miR-206 en el músculo esquelético (b) y miR-122 en el hígado (c). (Tomada de Erno Wienholds, Wigard Kloosterman, et al., Science 309:311, 2005, cortesía de Ronald H. A. Plasterk; © copyright 2005, American Association for the Advancement of Science.) (a) (b) (c)

52 FIGURA 11-40 Diferencias entre un código genético superpuesto y uno no superpuesto.
El efecto en el contenido de la información de un mRNA por una sola sustitución de bases depende de si el código está superpuesto o no. Los codones afectados están subrayados en rojo.

53 FIGURA 11-41 El código genético.
Esta carta universal de codificación lista cada uno de los 64 codones de mRNA posibles y el aminoácido correspondiente especificado por ese codón. Para usar la carta y traducir el codón UGC, por ejemplo, se debe encontrar la primera letra (U) en la fila indicada a la izquierda. Se sigue la fila de la derecha hasta encontrar la segunda letra (G) señalada en la parte superior; después se encuentra el aminoácido que coincide con la tercera letra (C) en la fila a la derecha. UGC codifica la inserción de cisteína. Cada aminoácido (excepto dos) posee dos o más codones que ordenan su inserción, lo cual hace al código genético degenerado. Un aminoácido particular tiende a ser codificado por codones relacionados. Esta característica reduce la probabilidad de que las sustituciones de bases resulten en cambios de la secuencia aminoacídica de una proteína. Los aminoácidos con propiedades similares también tienden a estar agrupados. Los aminoácidos con cadenas laterales ácidas se muestran en rojo, aquellos con cadenas laterales básicas en azul, los que tienen cadenas laterales polares sin carga en verde y aquellos con cadenas laterales hidrófobas en café. Como se revisa en la siguiente sección, la decodificación en la célula la llevan a cabo los tRNA, algunos de los cuales se ilustran de forma esquemática en el lado derecho de la figura..

54 FIGURA 11-42 Estructura bidimensional de los RNA de transferencia.
(a) Secuencia nucleotídica de un tRNAAla de levadura en forma de trébol. El aminoácido se une al extremo 3' del tRNA, mientras que el extremo opuesto porta el anticodón, en este caso IGC. La función del anticodón se revisa más tarde. Aparte de las cuatro bases, A, U, G, y C, este tRNA contiene: ψ, seudouridina; T, ribotimidina; mI, metilinosina; I, inosina; me2G, dimetilguanosina; D, dihidrouridina; meG, metilguanosina. Los sitios de las 10 bases modificadas en este tRNA se indican con el sombreado a color. (b) Representación general del tRNA en forma de trébol. Las bases comunes a todos los tRNA (en procariotas y eucariotas) se indican con las siguientes letras: R es una purina invariable, Y una pirimidina invariable y ψ una seudouridina invariable. La variabilidad mayor entre los tRNA ocurre en el brazo V (variable), que oscila entre cuatro y 21 nucleótidos. Hay dos sitios de menor variabilidad a lo largo del brazo D.

55 FIGURA 11-43 Estructura de un tRNA.
(b) FIGURA Estructura de un tRNA. (a) Estructura bidimensional de un fenilalanil-tRNA de levadura con las diferentes regiones de la molécula en código de color para correlacionar con el dibujo de la parte b. (b) Estructura tridimensional de un tRNAPhe derivado de la cristalografía de rayos X. El brazo aceptor amino (AA) y el brazo TψC (T) forman una doble hélice continua y el brazo del anticodón (AC) y el brazo D crean una doble hélice parcialmente continua. Estas dos columnas de hélices forman una molécula semejante a una L. (b: cortesía de Mike Carson.)

56 FIGURA 11-44 El bamboleo en la interacción entre codones y anticodones.
En algunos casos, el nucleótido en el extremo 5' terminal del tRNA anticodón es capaz de aparearse con más de un nucleótido en el extremo 3' (tercera posición) del codón de mRNA. En consecuencia, más de un codón puede usar el mismo tRNA. Las reglas para el pareamiento en el esquema del bamboleo se indican en la figura y el texto.

57 FIGURA 11-45 Esquema tridimensional de la interacción entre un tRNA y su aminoacil-tRNA sintetasa.
La estructura cristalina de la glutaminil-tRNA sintetasa de E. coli (en azul) forma un complejo con el tRNAGln (se indica en rojo y amarillo). La enzima reconoce este tRNA específico y discrimina otros a través de la interacción con el brazo aceptor y el anticodón del tRNA. (Tomada de Thomas A. Steitz, Science vol. 246, portada del 12/1/89; © American Association for the Advancement of Science.)

58 FIGURA 11-46 Inicio de la síntesis de proteínas en bacterias.
En el paso 1, el inicio de la traducción comienza con la vinculación de la subunidad ribosómica 30S con el mRNA en el codón de inicio AUG, un paso que requiere IF1 e IF3. La subunidad ribosómica 30S se une al mRNA en el codón de inicio AUG como resultado de una interacción entre una secuencia nucleotídica complementaria en el rRNA y mRNA, como se revisa en el texto. En el paso 2, la formilmetionil-tRNAfMet se relaciona con el mRNA y el complejo de la subunidad ribosómica 30S mediante el enlace a IF2-GTP. En el paso 3, la subunidad 50S se une al complejo, el GTP se hidroliza y el IF2-GDP se libera. El tRNA iniciador entra al sitio P del ribosoma, mientras que todos los tRNA subsecuentes ingresan al sitio A (fig ).

59 FIGURA 11-47 Inicio de la síntesis de proteínas en eucariotas.
Como se señala en el texto, el inicio comienza con la unión de dos complejos, uno (llamado complejo 43S) contiene la subunidad ribosómica 40S unida a varios factores de inicio (eIF) y el tRNA iniciador, mientras que el otro posee el mRNA unido a un grupo separado de factores de inicio. Esta unión es mediada por una interacción entre eIF3 en el complejo de 43S y eIF4G en el complejo del mRNA. Una vez que el complejo de 43S se ha unido al extremo 5' del mRNA, recorre el mensaje hasta alcanzar el codón de inicio apropiado AUG.

60 FIGURA Modelo de un ribosoma bacteriano basado en datos de cristalografía de rayos X que muestra los tRNA unidos a los sitios A, P y E de las dos subunidades ribosómicas. (a-b) Vista de las subunidades 30S y 50S, respectivamente, con los tres tRNA unidos mostrados en la interfase entre las subunidades. (a'-b') Representaciones que corresponden a las estructuras que aparecen en las partes a y b. El dibujo en a' de la subunidad 30S ilustra las localizaciones aproximadas de los anticodones de los tres tRNA y sus interacciones con los codones complementarios del mRNA. El dibujo en b' de la subunidad 50S muestra los sitios del tRNA en dirección inversa. El aceptor terminal de aminoácidos de los tRNA de los sitios A y P están muy próximos en el sitio del peptidilo de transferencia de la subunidad, en donde ocurre la formación del enlace peptídico. Los sitios de unión para los factores de elongación EF-Tu y EF-G se hallan en la protuberancia hacia el lado derecho de la subunidad. (Continúa…) (a) (b) (a’) (b’)

61 FIGURA Modelo de un ribosoma bacteriano basado en datos de cristalografía de rayos X que muestra los tRNA unidos a los sitios A, P y E de las dos subunidades ribosómicas. (Continuación) … (c) Dibujo del ribosoma procariota 70S que señala el espacio entre las dos subunidades ocupado por cada molécula de tRNA y el conducto dentro de la subunidad 50S a través del cual el polipéptido recién formado sale del ribosoma. (a y b: tomadas de Jamie H. Cate et al., cortesía de Harry F. Noller, Science 285:2100, 1999; a', b' y c: tomadas de A. Liljas, Science 285:2078, 1999; © 1999 American Association for the Advancement of Science.) (c)

62 FIGURA Pasos en la elongación del polipeptido recien formado durante la traducción en bacterias (a) En el paso 1, un aminoacilt RNA cuyo anticodón es complementario del segundo codón del mRNA entra al espacio vacío A del ribosoma. La unión del tRNA se acompaña de la liberación de EF-Tu-GDP. En el paso 2, la formación del enlace peptídico se acompaña de la transferencia de la cadena polipeptídica naciente desde el tRNA en el sitio P hacia el aminoacil-tRNA en el sitio A, con lo cual se forma un dipeptidil-tRNA en el sitio A y un tRNA desacilado en el sitio P. La reacción la cataliza en parte el rRNA que actúa como ribozima. En el paso 3, la unión de EF-G y la hidrólisis de su GTP adjunto resultan en la translocación del ribosoma sobre el mRNA. La translocación opera junto con el movimiento del tRNA desacilado y la peptidil-tRNA en los sitios E y P, respectivamente. En el paso 4, el tRNA desacilado deja el ribosoma y un nuevo aminoacil-tRNA entra al sitio A. (Continúa…) (a)

63 FIGURA Pasos en la elongación del polipeptido recien formado durante la traducción en bacterias. (Continuacón) … (b) Formación del enlace peptídico y el desplazamiento posterior del tRNA desacilado. Un ribosoma puede catalizar la incorporación de cerca de cinco aminoácidos por segundo a un polipéptido en crecimiento, lo cual es casi 10 millones de veces mayor que lo observado en la reacción no catalizada que emplea los sustratos modelo en solución. (b)

64 FIGURA 11-50 Polirribosomas.
(a) Dibujo esquemático de un polirribosoma (polisoma). (b) Este modelo tridimensional se generó a partir de tomografías crioelectrónicas de polisomas bacterianos en el acto de traducción in vitro. Para obtener las tomografías, las preparaciones se vitrificaron (congeladas para obtener hielo parecido al vidrio, sin formación de cristales de hielo) en etano líquido a −196°C. Luego se tomaron micrografías electrónicas con el espécimen colocado en varios ángulos de inclinación, lo que aportó datos para generar una reconstrucción tridimensional. (Continúa…) (a) (b)

65 FIGURA 11-50 Polirribosomas. (Continuación)
… (c) Micrografía electrónica de un corte por raspadura a través del borde externo de una cisterna del ER rugoso. Los ribosomas están alineados en asas y espirales, lo que indica su unión con moléculas de mRNA para formar polisomas. (b: tomada de Florian Brandt et al., por cortesía de Wolfgang Baumeister, Cell 136:267, 2009, con autorización de Cell Press. c: por cortesía de E. Yamada.) (c)

66 FIGURA 11-51 Visualización de la transcripción y la traducción.
(b) FIGURA Visualización de la transcripción y la traducción. ( a) Micrografía electrónica de partes de un cromosoma de E. coli que participa en la transcripción. El DNA se observa en la forma de líneas muy tenues que discurren a lo largo de la foto, en tanto que las cadenas del mRNA naciente se observan fijadas a uno de sus extremos, al parecer por una molécula de RNA polimerasa. Las partículas relacionadas con los RNA nacientes son ribosomas en el momento de la traducción; en bacterias, la transcripción y la traducción ocurren de manera simultánea. Las moléculas de RNA aumentan de longitud conforme crece la distancia al sitio de inicio. (b) Micrografía electrónica de un polirribosoma aislado de células de glándula de gusano de seda que producen gran cantidad de la proteína fibrosa de la seda. Esta proteína es lo suficientemente grande para ser visible en la micrografía (las flechas apuntan a las cadenas de los polipéptidos emergentes). (b: reimpresa con la autorización de Oscar L. Miller, Jr., Barbara A. Hamkalo y C. A. Thomas, Science 169:392, 1970; © 1970 American Association for the Advancement of Science; b: cortesía de Steven L. Mc- Knight y Oscar L. Miller, Jr.)

67 VÍAS EXPERIMENTALES FIGURA 1 RNA ribosómico purificado de Tetrahymena marcado con 32P, transcrito en concentraciones diferentes de (NH4)2SO4 y analizado por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Los números en la parte superior indican la concentración de sulfato de amonio. Se presentan dos grupos de muestras, “la forma nativa” y la forma desnaturalizada por calor. Las muestras del último grupo se sometieron a ebullición por 5 min en amortiguador y se incubaron en hielo para disociar cualquier molécula que se mantuviera unida con puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. Las dos columnas de la derecha contienen rRNA bacterianos 16S y 23S, que proveen los marcadores de tamaño conocido con los cuales se pueden comparar las otras bandas en el gel. Puede observarse a partir de las posiciones de las bandas que a medida que la concentración de sulfato de amonio aumenta, aparecen los RNA pequeños cuyo tamaño es igual a los intrones aislados (SI, secuencia interpuesta). Estos datos suministran la primera indicación de que el rRNA es capaz de cortar el intrón sin la ayuda de otros factores adicionales. (Tomada de T. R. Cech et al., Cell 27:488, 1981; con autorización de Cell Press.)

68 VÍAS EXPERIMENTALES FIGURA 2
Resultados de la electroforesis en geles de poliacrilamida de las mezclas de reacción que contenían el precursor del tirosinil-tRNA (pTyr) y el precursor de otro RNA llamado RNA 4.5S (p4.5). Se describe sólo el pTyr, que se procesa por lo general mediante la ribonucleasa P en dos moléculas de RNA, Tyr y 5'-Tyr (que es el extremo 5' del precursor). Las posiciones en las cuales estos tres RNA (pTyr, Tyr y 5'- Tyr) migran durante la electroforesis se indican en el lado izquierdo del gel. La línea 1 muestra los RNA que aparecen en la mezcla de reacción cuando pTyr (y p4.5) se incuba con la ribonucleasa P completa. Muy poco del pTyr permanece en la mezcla y se transforma en dos productos (Tyr y 5'-Tyr). La línea 5 señala los RNA que aparecen en la mezcla de reacción cuando pTyr se incuba con el componente proteínico purificado de la ribonucleasa P. La proteína no corta al precursor del tRNA, como es evidente, por la ausencia de bandas en las que los dos productos deberían migrar. En cambio, cuando pTyr se incuba con el componente del RNA purificado de la ribonucleasa P (línea 7), el pTyr se procesa de manera eficiente como al utilizar la ribonucleoproteína intacta. (Tomada de Cecilia Guerrier-Tokada et al. Cell 35:850, 1983; con autorización de Cell Press.)

69 VÍAS EXPERIMENTALES FIGURA 3
Un modelo molecular de una porción de la subunidad RNA catalítica de la ribonucleasa P bacteriana (en blanco) y su sustrato unido, el tRNA precursor (en rojo). El sitio del tRNA precursor, donde lo corta la ribozima, se indica con una esfera en amarillo. (Cortesía de Michael E. Harris y Norman R. Pace.)