Bases Fisiológicas del Aprendizaje y la Memoria

Presentación del tema: "Bases Fisiológicas del Aprendizaje y la Memoria"— Transcripción de la presentación:

1 Bases Fisiológicas del Aprendizaje y la Memoria
William James (1890): “When two elementary brain-processes have been active together or in immediate succession, one of them, on reoccurring, tends to propagate its excitement into the other.”

2 Santiago Ramón y Cajal (~1890):
Los procesos de aprendizaje y memoria son mediados por cambios en la estructura de las conexiones sinápticas.

3 Donald O. Hebb (1949) “When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently takes part in firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such that A's efficiency, as one of the cells firing B, is increased. “ A C B

4 Formación de Engramas “Let us assume that the persistence or repetition of a reverberatory activity (or "trace") tends to induce lasting cellular changes that add to its stability” (Hebb, 1949)

5 En el contexto de este curso se utilizarán las siguientes definiciones:
Aprendizaje: Modificación de una conducta anterior o adquisición de una nueva conducta, debido a la experiencia. La posibilidad de evocar posteriormente esta nueva conducta, al recrear las condiciones en las que ésta fue aprendida, indica que se formó una memoria. Plasticidad Sináptica: Cambios en la eficiencia sináptica (potenciación o depresión de la función sináptica) producidos por ciertos patrones de actividad sináptica.

6 PLASTICIDAD SINÁPTICA
APRENDIZAJE Y MEMORIA Hipótesis: Durante un proceso de aprendizaje, se producen cambios plásticos en la eficiencia de las sinapsis (de los circuitos neuronales involucrados), inducidos por actividad sináptica intensa. Estas modificaciones y su persistencia en el tiempo constituyen la base fisiológica del aprendizaje y la memoria. Notar que se trata de un problema difícil de estudiar a nivel de un organismo, porque es necesario conocer los circuitos neuronales involucrados en cada proceso de aprendizaje y en la generación de una determinada conducta. Estos circuitos generalmente involucran a distintas regiones del cerebro, el que, como muestra la siguiente diapositiva, es un sistema de enorme complejidad:

7 The human brain has... ~1011 Neurons
~104 Synapses per nerve cell (some neurons, e.g. Purkinje cells, form even >100,000 synaptic contacts) in total ~1015 synapses ~109 synapses per mm3 wiring (axons) of about 106 km length a typical synapse has the size of E. coli bacterium Diap E Gundelfinger E. Gundelfinger

8 En este curso veremos ejemplos de plasticidad sináptica y su correlación con memorias de corta y larga duración, que involucran circuitos relativamente simples en un invertebrado (Aplysia californica, un caracol de mar). También estudiaremos ejemplos de plasticidad sináptica dependiente de actividad en el hipocampo de rata (estructura involucrada en la generación de algunos tipos de memoria). En los seminarios se discutirán trabajos en que se ha estudiado la correlación entre memoria y plasticidad sináptica en esta estructura cerebral.

9 Plasticidad Sináptica:
Cambios en la eficiencia sináptica (potenciación o depresión) generados por la misma actividad sináptica. Efectos de corta duración: ms - min Efectos de larga duración: horas – semanas - años

10 Plasticidad sináptica y memoria de corta duración:
Veremos que: Plasticidad sináptica y memoria de corta duración: Estos cambios involucran modificaciones transitorias en canales de iones y en sistemas de mensajeros secundarios. Plasticidad sináptica y memoria de larga duración: Requiere de síntesis de proteínas y cambios estructurales en las conexiones sinápticas.

11 Registro en rebanadas de cerebro

12 Preparación de rebanadas de cerebro de rata
Rebanadas de mm de espesor Hipocampo Esta preparación permite realizar registros electrofisiológicos en neuronas que conservan su conectividad intacta

13 ¿Cómo se registran los potenciales postsinápticos?

14 registro intracelular
I-clamp 5 mV 10 ms “EPSP”: excitatory postsynaptic potential V-clamp También es posible registrar las corrientes postsinápticas: “EPSC”: excitatory postsynaptic current Vhold= -60 mV

15 registro extracelular
5 mV 10 ms

16 Registro Extracelular:
La generación de corrientes sinápticas produce una caída de potencial en el medio externo, que puede registrarse mediante dos electrodos extracelulares.

17 5 mV 10 ms registro extracelular decenas-cientos de µV En regiones con alta densidad de neuronas ordenadas en capas, como el hipocampo o la corteza, se registra un potencial sináptico de campo o field EPSP (fEPSP), que puede tener una amplitud de unos pocos mV “fEPSP”: field excitatory postsynaptic potential

18 ¿Cómo se registran los potenciales postsinápticos?
EPSP 5 mV 10 ms 1 mV fEPSP

19 Plasticidad sináptica de corta duración (seg – min), conceptos generales

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21 Δt = 50 ms Ejemplo de plasticidad de corta duración:
Facilitación de Pulsos Pareados (Pair Pulse Facilitation, PPF) 10 ms 0.4 mV Registro de potenciales sinápticos de campo (fEPSP) en rebanadas de hipocampo de rata Δt = 50 ms

22 Facilitación de Pulsos Pareados
Pair Pulse Facilitation (PPF)

23 Matthews, 2001

24 Matthews, 2001

25 Potenciacion Post-Tetánica (PTP)
Nota: el número y frecuencia de potenciales de acción presinápticos necesarios para inducir estos tres tipos de plasticidad de corta duración, puede variar, dependiendo de las sinapsis que se están estudiando. Matthews, 2001

26 Post Pre 4 Hz, 25 s Ejemplo de Potenciación Post-Tetánica (PTP, ver clase Sinapsis II, J. Alcayaga) detalle de b Registros intracelulares simultáneos de neuronas pre y postsináptica. La presináptica es estimulada por pulsos breves de corriente de modo que por cada estímulo ésta descarga un potencial de acción (b y c). En a) se muestran los potenciales sinápticos (EPSP) inducidos en la neurona postsináptica. R KRETZ, E SHAPIRO, & ER KANDEL Proc. Nat Acad. Sci. USA 79 (1982)

27 Se correlaciona la existencia de PPT con la presencia de corriente de K+ activada por Ca2+ (sensor de Ca2+ intracelular) Post Pre Registro de corriente (V-clamp), TTX, se aplican pulsos despolarizantes para imitar espigas y liberar neurotransmisor IK(Ca) Comienza inyección de EGTA en célula presináptica Ignorar (escaneo)

28 correlación entre amplitud
Después del tétano: correlación entre amplitud de EPSP y IK(Ca). la transmisión por efecto del EGTA) Notar que finalmente ambos son inhibidos por efecto del EGTA Tiempo de decaimiento de PPT disminuye al bajar la concentración de Ca2+

29 Facilitación, aumentación, potenciación post-tetánica:
Son causados por acumulación de calcio en el terminal presináptico.

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32 Depresión sináptica de corta duración: mecanismos implicados se localizan en terminales presinápticos Disminución del pool de vesículas rápidamente liberables Inhibición por Ca2+ de canales de Ca2+ Activación de canales de K+ activados por Ca2+ Activación de receptores presinápticos acoplados a proteína G (modulación de canales dependientes de voltaje): a) Circuito multisináptico de retroalimentación negativa. b) Autorreceptores. Matthews, 2001

33 Diferentes tipos de modificaciones presinápticas (potenciación o depresión):
Acumulación de calcio presináptico puede producir: a) Efecto directo sobre la liberación de vesículas (pool de liberación rápida). b) Alteraciones en el reciclaje de vesículas. c) Modulación de canales de iones efectos sobre Ca2+ intracelular Activación de receptores acoplados a proteína G presinápticos: a) Modulación de canales de iones efectos sobre Ca2+ intracelular

34 Conexión con Aprendizaje y Memoria: Algunos ejemplos sencillos en un organismo “sencillo”.
Aplysia californica

35 Ejemplos de aprendizaje relacionados con dos conductas reflejas en Aplysia:
Habituación: reducción en la respuesta a un estímulo inocuo que se repite. Sensibilización: aumento de la respuesta producido por un estímulo intenso (estímulo sensibilizante)

36 Reflejo sifón - branquia
Reflejo cola - sifón Estímulación táctil de la cola (estímulo doloroso para el animal) produce la contracción de la cola y branquia Estímulación táctil del sifón (estímulo neutro para el animal) produce la contracción de la branquia

37 Habituación: Sensibilización:
Reflejo sifón - branquia Reflejo cola - sifón Habituación: Después de varios estímulos, la respuesta deja de expresarse. Sensibilización: Al aplicar un estímulo intenso en la cola, un posterior estímulo sobre el sifón produce la retracción de la cola y branquia. Esto ocurre incluso cuando previamente se ha inducido habituación.

38 estímulo sensibilizante táctil neurona sensitiva neurona motora branquia interneurona facilitadora sifón cola 20 mV 100 ms Circuito neuronal involucrado en la generación del reflejo sifón–branquia: Registros intracelulares in vivo

39 Registro simultáneo de neurona sensitiva y motoneurona
EPSP inducido en neurona motora 24 neuronas sensitivas 3 interneuronas Estimulación por pulso de corriente induce descarga de un pot. de acción en neurona sensitiva 6 motoneuronas

40 Habituación Una sesión de 10 estímulos táctiles:
Luego de 10 estímulos táctiles sobre el sifón Una sesión de 10 estímulos táctiles: Habituación de corta duracion (min). 4 sesiones de 10 estímulos, separadas por horas: Habituación de larga duración (semanas).

41 ¿Mecanismo de la habituación?
Esquema del ganglio abdominal de la Aplysia y del protocolo experimental (el mismo que en la diapositiva anterior). El registro de las respuestas sinápticas en motoneuronas muestra que la estimulación repetida de las neuronas sensitivas produce una depresión de la transmisión sináptica: neurona motora neurona sensitiva En principio, podría tratarse de un cambio en la liberación de neurotransmisor o en la función de los receptores postsinápticos. Castellucci y Kandel, 1974

42 Liberación Cuántica de Neurotransmisor
Repaso Liberación Cuántica de Neurotransmisor El EPSP se genera cuando un número grande de vesículas o cuantas se libera simultáneamente, cada cuanta tiene sólo dos posibilidades, ser liberado o no. La probabilidad de liberación de cada cuanta es independiente de las demás. Si hay n sitios de liberación, la probabilidad (pi) de observar i cuantas está dada por: Analogía: Se lanzan n monedas, en cada caso puede salir cara o sello. pi es la probabilidad de tener i sellos. Distribución Binomial n = cuantas liberables (sitios de liberación) p = probabilidad de liberación en cada sitio Nota: Si se hacen muchos experimentos, el número promedio de cuantas liberados, m, será m = np

43 En bajo calcio la probabilidad de liberación (p) es muy baja y la probabilidad de observar un epp compuesto por i cuantas (0, 1, 2, 3, etc) se aproxima a una Distribución de Poisson: (m = np) El parámetro m se obtiene experimentalmente al registrar un número grande de potenciales sinápticos evocados y espontáneos: m = contenido cuántico (número promedio de cuantas liberados por impulso) <epp>: promedio de los potenciales evocados <mepp>: promedio de los potenciales espontáneos DEF: <mepp> o “q”= tamaño cuántico (amplitud promedio del potencial sináptico generado por la liberación espontánea de una vesícula) El análisis de la probabilidad de fallo (i=0): po = e-m → m = ln(1po) constituye un modo alternativo de obtener m.

44 Ejemplo: Análisis de liberación cuántica de neurotransmisor (bajo calcio extracelular), en la placa neuromuscular: Análisis de epp: Análisis de mepp (cuantas): Curva de Gauss i = 1 2 3 Construcción de la curva teórica: #i = Npi #i: Nro. observaciones, grupo i N: Nro. de experimentos 1. Se determinó m: 2. Se calculó pi (i=0,1..): 3. El Nro. de observaciones de cada grupo se distribuyó en gaussianas con media i*<mepp> y varianza i*var <mepp> Ec. Poisson

45 Otra herramienta útil es determinar el coeficiente de variación de las respuestas evocadas:
CV = (Desv. Est.)/media Para una distribución de Poisson, se cumple: CV = (m)1/2/m = m-1/2 Por lo tanto, m = 1/(CV) Método alternativo para calcular m.

46 Determinación experimental de q y m (resumen):
El valor de q se estima a partir del primer pico del histograma de amplitudes o del valor promedio de los minis (mepp o mEPSP). El valor de m puede determinarse de las siguientes maneras: a) De la expresión m = <epp>/q b) De la probabilidad de fallos: m = ln(1po) c) Del coeficiente de variación. m = 1/(CV)2

47 ¿Mecanismo de la Habituación?
Castellucci y Kandel (1974) realizaron un análisis cuántico de la liberación de neurotransmisor desde las neuronas sensitivas del ganglio abdominal, hacia las motoneuronas que inervan la branquia, durante el proceso de habituación. Se evaluaron posibles cambios en q o m: Esquema del ganglio abdominal de la Aplysia y del protocolo experimental (detalles en leyenda adjunta) B neurona motora (post) neurona sensitiva (pre) Synaptic depression at the synapse between mechanoreceptor neurons and motor neurons. A. Diagram of the abdominal ganglion of Aplysia showing schematic innervation of gill and siphon and illustrating simultaneous recording from gill motor neuron (L7) and a mechanoreceptor sensory neuron. B. Synaptic depression of the monosynaptic EPSP produced in motor cell L7 by stimulation of a single sensory neuron in high divalent cation solution (138 mM Mg++, 62 mM Ca++). Interstimulus interval (I.S.I.) 10 sec. Régimen de baja liberación de neurotransmisor: concentración Mg2+ ext./ Ca2+ ext.: 138 mM / 8 mM (las concentraciones normales son 55 mM/11 mM). Se aplican 200 estímulos presinápticos espaciados por 10 s y se registran los EPSPs (en este régimen es necesario aplicar muchos más estímulos para ver habituación, lo que hace posible tener una muestra mayor). Castellucci y Kandel (1974), Proc. Nat. Acad. Sci.71(12):

48 Fluctuaciones cuánticas de las respuestas evocadas durante el proceso de depresión sináptica
De la secuencia de 200 estímulos, se consideraron tres regiones para el análisis estadístico (ver leyenda adjunta) fallo Notar fluctuaciones en amplitud en primera serie (parte de la primera región muestral) Quantal fluctuations accompanying synaptic depression at a low level of release (165 mM Mg++, 8 mM Ca++). Samples of successive EPSPs evoked in L7 by a series of 200 consecutive intracellular stimuli to the sensory neuron at 10-sec intervals. Total membrane potential shift during the series was less than 1 mV. Samples are taken from consecutive responses in three different plateau regions (in which the average EPSP did not decrease by more than 15%). The first region (see examples 5 to 8) shows marked amplitude fluctuations and no Failures. In regions 2 and 3 there is a progressive increase in the number of failures (arrows). Number beside each pair of traces refers to the stimulus number in the series. The amplitude histograms of the EPSPs (ver siguiente figura) were obtained by measuring the magnitude of the response in time intervals (window) between the peak of the presynaptic spike and the peak of the-first EPSP. Notar que junto a la depresión sináptica progresiva se observa un aumento en el número de fallos. Castellucci y Kandel, 1974.

49 Histogramas de amplitud para las tres regiones (A, B: distintos experimentos)
Ejemplo de promedios de EPSP y fallos C m1=3.0 m1=3.9 m1=1.7 m1=1.8 Nota: “AV. UNIT” corresponde al promedio de los EPSP unitarios (grupo de EPSP mínimos registrados que se supone corresponden a la liberación de una vesícula: “q1” ). En este experimento NO se estudiaron los mEPSP (espontáneos). Amplitude histograms and computer averages of unitary EPSPs and failures during synaptic depression. (Parts A-B) Two sets of amplitude histograms of successive EPSPs during the synaptic depression accompanying 144 to 219 consecutive intracellular stimuli to the sensory neuron. The regions refer to periods of stable responses. The first response peak was assumed to be the amplitude of a unitary EPSP (q1). The successive peaks were roughly integral multiples of the initial peak. From the value of m1 obtained from these amplitude histograms a predicted curve (broken line) was generated assuming a Poisson distribution and a coefficient of variation for q1 of 30%. Roman numerals refer to the successive multiples of the estimated unit potential. Arrows on the abscissa refer to the mode (m1). The mode shifts to the left (more failures) with repeated stimulation. N = number of stimuli; the two values in parentheses refer to the first and last EPSP of the plateau region (E) Computer averages of the unitary EPSPs and failures during the synaptic depression accompanying 200 consecutive stimuli. The failure average resembled the background noise average. m1=0.9 m1=1.2 Notar la disminución gradual en el número promedio de vesículas liberadas (m), durante el proceso de habituación En este trabajo se calculó q y m por tres métodos distintos, aquí se ilustra el primero. q1 se obtuvo del primer peak del histograma (correspondiente a “AV. UNIT” en C) y m1 se obtuvo del cuociente AV. EPSP/q1.

50 Resumen del análisis cuántico de la depresión sináptica
(se muestran resultados de una célula) Métodos alternativos para calcular m y q: m2 se calculó a partir del número de fallos y m3 a partir del Coef. de Variación (CV). En cada caso, se obtuvo q a partir de la relación m = <EPSP>/q. Notar que mientras q se mantiene constante durante el proceso de depresión sináptica, m disminuye gradualmente. Estos resultados sugieren que el mecanismo de plasticidad no radica en una modificación de los receptores postsinápticos (la liberación de una vesícula siempre produce el mismo EPSP unitario), sin embargo, cada impulso libera una cantidad menor de vesículas (disminución de la probabilidad de liberación).

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52 4 sesiones de 10 estímulos Habituación de larga duración (días).

53 Sensibilización: aumento en la respuesta a un estímulo táctil (inocuo) después de la exposición a un estímulo intenso (doloroso). estímulo sensibilizante táctil neurona sensitiva neurona motora branquia interneurona facilitadora sifón cola control sensibilizado 24 neuronas sensitivas (sifón) 6 neuronas motoras (branquia)

54 Cuál es el mecanismo de la facilitación?
Como vimos, la estimulación repetida de una neurona sensitiva del sifón produce depresión sináptica. La posterior estimulación (mecánica) de la cola, produce una facilitación de las respuestas, consistente con la conducta de sensibilización. Estimulación de la cola (1 vez) Cuál es el mecanismo de la facilitación?

55 La aplicación extracelular de AMPc (análogo permeable) o de serotonina (5-HT) imita el efecto de la sensibilización. 5-HT (2 uM) 5-HT (20 uM) Aplicación extracelular de serotonina (5-HT) cAMP Brunelli et al, Science.194(4270):

56 Registro de potenciales de acción evocados en neurona sensitiva antes y después del tratamiento que se indica. Nota: los experimentos se hicieron en presencia de una concentración baja de TEA, para hacer más lenta la repolarización y ver más claramente los efectos) Después de estimulación de la vía conectiva (la que media la conducta de sensibilización) IBMX: Inhibidor de fosfodiesterasa Estimulación vía conectiva

57 La corriente S es una corriente de potasio independiente del potencial cuya modulación afecta el potencial de reposo y la duración de las espigas en las neuronas sensitivas de aplysia. 5-HT inhibe la actividad de los canales S, actuando a través de la vía del AMPc y PKA (fosforila los canales).

58 Modelo propuesto para el mecanismo de la sensibilización:
S-type K channels

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60 Sensibilización de larga duración inducida por estimulación repetida de la cola
MAPK La generación de esta memoria de largo plazo requiere de transcripción génica y síntesis de nuevas proteínas. Uno de los resultados es la activación constitutiva de PKA y la fosforilación persistente de sus blancos: canales iónicos y otras proteínas involucradas en el crecimiento de nuevas conexiones sinápticas.

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62 Cambios estructurales asociados a habituación y sensibilizacion de larga duración en Aplysia