TOXICOLOGIA En el momento actual se reconoce que la Toxicología es una ciencia multidisciplinaria. Esta característica es una de las razones del rápido.

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1 TOXICOLOGIA En el momento actual se reconoce que la Toxicología es una ciencia multidisciplinaria. Esta característica es una de las razones del rápido desarrollo de la Toxicología en los últimos años, gracias a las contribuciones de profesores, investigadores y profesionales de muy diferente formación inicial ( Repetto, 1.995). Existen muchas definiciones de la misma; una de las más completa es la siguiente: Toxicología - es la ciencia que estudia las sustancias químicas en cuanto que son capaces de producir alteraciones patológicas en los seres vivos, con sobrevida- con o sin secuelas - o muerte , estudia los mecanismos de producción de dichas alteraciones y los medios para contrarrestarlas – antídotos o antagonistas - , así como los procedimientos para detectar, identificar y cuantificar tales agentes y evaluar su grado de toxicidad , como también su dispersión en el medio ambiente ( Repetto, y 1.997).

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3 Productos Químicos Exposición Efectos
Toxicidad : Capacidad para producir daño a un organismo vivo en relación a la cantidad de sustancia administrada o absorbida, la vía de administración, y su distribución en el tiempo Dosis: Cantidad de sustancia por kilogramo de peso que es capaz de producir un efecto en 24 horas

4 A-Intoxicación Aguda B- Intoxicación Crónica salud a c a c
Intoxicaciones y sus clases A-Intoxicación Aguda B- Intoxicación Crónica salud a c a c d e d f tiempo b a- estado de salud b- posibilidad de muerte c- recuperación total d- recuperación con secuelas e/f - progresivos déficit salud enfermedad b

5 Intoxicación crónica : Absorción repetida de un toxico en largos
Intoxicación aguda : Única dosis con aparición de sintomatología antes de las 24 horas Toxicidad Aguda Toxicidad Crónica Intoxicación crónica : Absorción repetida de un toxico en largos periodos de tiempo

6 Distintos Tiempos en un proceso tóxico
Absorción Máximo -Muerte- Desaparición Aparición Latencia Duración del efecto

7 Agente Xenobiótico Etimología: “Ajeno a la vida”, todo cambio significativo en la composición o condiciones naturales de un medio constituye una forma de contaminación que afectan al recurso en sí o a su uso para un fin determinado Los agentes que lo provocan pueden ser: químicos, físicos, biológicos El medio afectado puede ser aire, agua, suelo o cualquier sustrato orgánico Los agentes pueden producirse en forma espontánea o provocada por la actividad del hombre En cuanto a la composición puede ser una variación anómala en su proporción o la incorporación de sustancias que no se encuentran en el ambiente en forma normal e introducidas por la actividad del hombre

8 Características tóxicas del agente xenobiótico
Dosis Letal 50 (DL50) : Es la dosis que produce la muerte del 50% de los animales de un lote de experimentación. [DL50] = miligramos de compuesto por kilogramo de peso del animal A menor valor de la DL50 , más peligrosa es la sustancia respecto de otra de mayor magnitud. Sustancia Química DL50 mg/kg Etanol 10.000 Cloruro de sodio 4.000 Estricnina 2 Nicotina 1 Toxina Botulínica 0,00001

9 Dosis oral letal hombre adulto
Denominación DL50 oral rata Dosis oral letal hombre adulto Extremadamente tóxico Menor a 1 mg/Kg 1 gota Altamente tóxico 1 – 50 mg/Kg 1 cucharada ( 4 ml) Moderadamente tóxico 50 – 500 mg/Kg 30 g Ligeramente tóxico 0,5 – 5 g/Kg 250 g Prácticamente no tóxico 5 –15 g/Kg 1 litro Relativamente inocuo Mayor a 15 g/Kg Mayor a 1 litro

10 Pueden emplearse como indicadores , otros efectos diferentes
a los de la muerte Por ejemplo, Indicadores Biológicos de Exposición , los cuales pueden ser : A- Químicos : Concentración del toxico o sus metabolitos en fluidos biológicos B- Bioquímicos : modificación de parámetros bioquímicos fisiológicos ( Me Hb; actividad enzimática ,etc) C- Funcionales : Capacidad respiratoria, vol.min circulatorio D- Histológicos: Lesiones tisulares

11 Los marcadores biológicos, también denominados
determinantes o indicadores biológicos de exposición a un compuesto químico pueden ser, según su naturaleza, el propio compuesto, sus metabolitos característicos, productos procedentes de reacciones de conjugación del compuesto o de sus metabolitos que se puedan producir en los ciclos bioquímicos endógenos, formados por reacción del compuesto o por sus metabolitos con macromoléculas, interferencias bioquímicas o enzimáticas medibles, etc .

12 Los medios biológicos en los que se puede determinar la
presencia de los marcadores biológicos de exposición laboral están muy relacionados con las vías de entrada, distribución y eliminación de cada compuesto, así como con su naturaleza química La mayoría de las determinaciones biológicas se realizan en sangre, orina o aire exhalado

13 La sangre constituye el principal vehículo de transporte y
distribución de los compuestos químicos en el cuerpo, por tanto la mayoría de las sustancias biológicamente activas o sus metabolitos se pueden encontrar en este medio. La orina es fácil de recoger, se pueden utilizar grandes volúmenes de muestra y es también una técnica no invasiva. Las determinaciones en aire exhalado están limitadas a la exposición a compuestos orgánicos volátiles; es un método no invasivo y el mejor aceptado por la población por la sencillez de la toma de muestra .

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16 Vías o rutas de absorción
Barrera Biológica Cutánea Xenobiótico Distribución Gastrointestinal Alveolar Órgano blanco Placentaria Otras Efectos

17 Incorporación de los Tóxicos al organismo
Contaminante Vía Respiratoria Vía Dérmica Vía Digestiva

18 ECOTOXICOLOGIA # TOXICOLOGIA
Toxicología: estudia las interacciones nocivas entre sustancias químicas y organismo vivos Objeto de estudio: individuos Ecotoxicología: estudia los efectos de los contaminantes sobre los ecosistemas Objeto de estudio: poblaciones, comunidades, ecosistemas

19 ECOTOXICOLOGÍA Ecotoxicología: estudia el destino y los efectos de los contaminantes en los ecosistemas intentando explicar las causas y prever los riesgos probables Destino de los contaminantes: emisión, distribución, transporte, transformación (química/biológica), bioacumulación Efectos biológicos de los contaminantes: sobre las poblaciones, comunidades y ecosistemas Modificaciones en la estructura y funcionamiento del ecosistema: declinación de aves, diversidad de especies de algas, disminución/aumento de la productividad primaria Contaminante: toda forma de materia capaz de alterar, modificar o interferir en forma negativa con los elementos del ambiente siendo factor de riesgo para el hombre y otros seres vivos Efectos directos contaminantes: actúan sobre los individuos (y a través de ellos sobre las poblaciones, comunidades, ecosistemas) ejemplos: metales pesados, pesticidas Efectos indirectos contaminantes: actúan sobre el medio físico, ejemplos: sólidos suspendidos, materia orgánica

20 ECOTOXICOLOGÍA Efecto tóxico: es el producido por uno o varios agentes tóxicos sobre un organismo, población o comunidad que se manifiesta por cambios biológicos y su grado se evalúa por una escala de intensidad relacionada con la dosis (cantidad administrada/unidad de peso corporal) o la cc (sustancia aplicada al medio) del agente tóxico El efecto puede ser: Cuantal: presencia o ausencia de una característica Letal: muerte por acción directa consecuencia de la exposición Subletal: por debajo del nivel que causa la muerte Agudo: efecto que se manifiesta rápida y severamente después de un corto período de exposición: 0-96hs Crónico: efecto luego de un largo período de exposición (días o años) según la especie Combinado: dos o más sustancias aplicadas al mismo tiempo producen distintos efectos o modos de acción Potenciación o sinergismo: cuando la toxicidad de una mezcla es mayor a la esperada debido a la suma de toxicidades de los agentes individuales Inhibición o antagonismo: cuando la toxicidad es menor a la esperada debido a la suma de toxicidades de los agentes individuales

21 ECOTOXICOLOGÍA Ensayos de toxicidad: tienen como propósito determinar si los compuestos químicos tóxicos se encuentran en cantidades tóxicas No están pensados para predecir efectos sobre los ecosistemas en forma cuantitativa, aunque muchos estudios han demostrado la existencia de una asociación significativa entre los resultados de los ensayos y el impacto en los ecosistemas El bioensayo es un método utilizado para detectar y evaluar la capacidad inherente de un agente tóxico de producir efectos adversos sobre los organismos vivos Realizado en condiciones definidas y sobre organismos individuales o un grupo de organismos determinado se estudian las relaciones dosis o cc vs efecto o respuesta Ninguna especie aislada podría representar un ecosistema entero se recomiendan ensayos secuenciales incluyendo: algas, dàfnidos y peces

22 MEDICIONES EN BIOENSAYOS
Los efectos tóxicos a evaluar pueden ser: mortalidad, inmovilidad, inhibición del crecimiento, alteración del comportamiento, etc IC 50: concentración de la muestra que provoca una disminución o inhibición del 50% de la luminiscencia (Vibrio fisheri u otra bacteria) en un tiempo determinado CE 50: concentración efectiva de la muestra que provoca un efecto en el 50% de la población (Daphnia magna u otro invertebrado) en un tiempo determinado

23 COMO EMPLEAR LOS RESULTADOS DE LOS ENSAYOS DE TOXICIDAD
Clasificar efluentes en UTA (unidades tóxicas agudas) UTA = 1 / CE 50 x 100 CE hs (% v/v de efluente) UTA Caraterización del efluente < 25 % > 4 Muy tóxico 26 – 50 % 2 – 4 Tóxico 51 – 75 % 1.33 – 1.99 Moderadamente tóxico > 75 % < 1.33 Levemente tóxico

24 CONTROL DE DESCARGAS A CUERPOS RECEPTORES
Objetivo: asegurar que las descargas no contengan contaminantes tóxicos en cantidades tóxicas Monitoreo químico: control de sustancias específicas Biomonitoreo: Ensayos de toxicidad (WET o toxicidad total del efluente): no da información sobre tóxicos específicos, ni sobre el tratamiento o la persistencia ni los efectos sobre la salud humana pero, permite evaluar la toxicidad conjunta de todos los constituyentes de un efluente complejo o la reducción de los efectos tóxicos limitándose a medir un único parámetro su toxicidad Bioensayo: evaluación de la condición de un cuerpo de agua mediante el estudio de organismos residentes Factores de incertidumbre: condiciones de mezcla del efluente en el cuerpo receptor , variabilidad en la sensibilidad entre especies, variabilidad de toxicidad del efluente

25 COMO SE REALIZA UN ENSAYO DE TOXICIDAD CON EFLUENTES
Toma de muestra Conservación de la muestra Pretratamiento de la muestra Realización del ensayo

26 BIOENSAYOS Microtox (Vibrio fischeri)
Método rápido de toxicidad empleando Daphnia magna y KIT-TOX. Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)

27 BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX
Organismo de ensayo: Vibrio fischeri Una especie de bacteria marina Gram negativa Anaerobia facultativa Del género VIBRIÓN, familia Vibrionaceae Exhibe BIOLUMINESCENCIA

28 Vibrio fischeri Se encuentra en una relación simbiótica con el calamar sepiólide Euprymna scolopes El Euprymna scolopes posee una serie de apéndices recubiertos de mucosidad alrededor de su órgano luminoso con los que recoge bacterias Vibrio fischeri del entorno marino

29 Vibrio fischeri Principales características: La Bioluminiscencia (emisión de luz por parte de organismos vivos como resultado de sus actividades bioquímicas) Su gran sensibilidad que presenta a una amplia variedad de sustancias tóxicas

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Principio de la técnica: Se determina la inhibición de la luminiscencia de una suspensión de células de Vibrio fischeri como resultado de la exposición de dicha suspensión a diluciones de la muestra. Se somete a distintas diluciones (1,10, 45 y 90 %) durante distintos tiempos (5, 15, 30 min). También se hacen los controles, donde no se le suministra la muestra o toxina y se analiza la baja de la luminiscencia

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Expresión de los resultados: IC 50 (concentración de la muestra que provoca una disminución de la luminiscencia en un tiempo determinado ) Alcance: aguas residuales, lixiviados, aguas dulces superficiales o subterráneas o aguas saladas Tóxicos de referencia: permiten evaluar bajo condiciones estandarizadas la sensibilidad relativa de la bacteria luego de la reconstitución y la confiabilidad de los ensayos Fenol: IC50 5 min mg/l Cinc: IC50 15min mg/l Zn/l IC50 15min 3-10mg/l (Zn SO4.7H2O)

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Analizador de toxicidad aguda

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34 BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX
El software del equipo calcula la relación concentración/efecto para cada tiempo de exposición usando análisis por regresión lineal El resultado puede expresarse como IC50 (concentración inhibitoria 50) que es la concentración de la muestra a la cual se observa una disminución de la luminiscencia del 50%; este valor se calcula a partir de la curva concentración-respuesta (variable métrica) y representa la concentración a la cual la variable (en este caso la luminiscencia) es un 50% menor que el control El resultado también puede expresarse como porcentaje de inhibición: como resultado de la exposición de la suspensión de bacterias a una concentración de la muestra con respecto al control y se expresa en porcentaje, por ejemplo la muestra a una concentración del 20% causa un 65% de inhibición de la luminiscencia a los 15 minutos de exposición

35 BIOENSAYO DE TOXICIDAD MICROTOX
Interferencias: las pérdidas de luminiscencias por absorción de la luz o dispersión pueden suceder en caso de muestras turbias o fuertemente coloreadas y se compensa usando una cubeta de corrección de color (cubeta con cámara doble) Se requiere una concentración de oxígeno mayor a 0.5mg/l para que se produzca la luminiscencia las muestras con altas DBO pueden causar deficiencias o ser inhibitorias Limitaciones: sustancias insolubles, poco solubles, volátiles o cuyo estado se altere durante el período de ensayo puede afectar el resultado o su reproducibilidad Las concentraciones salinas en la muestra inicial que excedan los 30mg/l de ClNa pueden conducir a efector hiperosmóticos Conservación de las muestras: refrigeradas hasta 24hs y congeladas a -20°C durante 2 meses sin conservantes de carácter biocida

36 Métodos de detección de toxicidad empleando Daphnia magna
Organismo de ensayo: Daphnia magna Del orden de los Cladóceros de la clase Crustácea (pariente de los cangrejos) las especies del género Daphnia Se trata de una pequeña “pulga de agua” que mide de 1 a 3 mm Vive en lagos y lagunas, alimentándose de algas microscópicas y sirviendo, a su vez, de alimento a los peces Tiene un ciclo de vida corto (3 o 4 semanas) Reproducción partenogenética ( asegura una uniformidad de respuesta de los individuos )

37 Métodos de detección de toxicidad empleando Daphnia magna
Alta sensibilidad a los tóxicos; es capaz de acusar 0.005mg de mercurio en agua y menores concentraciones de pesticidas y residuos industriales Son las más usadas como organismos de prueba o de referencia en ensayos de toxicidad

38 Métodos de detección de toxicidad empleando Daphnia magna
Con Daphnia magna se hacen tres tipos de ensayos: Método rápido de toxicidad empleando Daphnia magna y KIT-TOX.( fluorescencia de sustrato bajo luz UV) Ensayo de toxicidad aguda (CL50 o CE50): la concentración del tóxico capaz de matar o inmovilizar el 50% de la población en 48hs Ensayo de toxicidad crónica: la evaluación se basa en la capacidad reproductiva o el crecimiento de los individuos.

39 Método rápido de toxicidad empleando Daphnia magna y KIT-TOX
Objetivo: Detección temprana de agentes contaminantes que hayan ingresado al agua Permite detectar la presencia de un alto rango de sustancias en un tiempo máximo de dos horas desde el inicio del ensayo

40 Método rápido de toxicidad empleando Daphnia magna y KIT-TOX.
Principio de la técnica: Los organismos que hayan estado expuestos a sustancias tóxicas, tendrán reducida su capacidad de ingerir y consecuentemente de clivar enzimáticamente un sustrato azucarado con marcado fluorescente La respuesta enzimática permite al usuario caracterizar la toxicidad de una muestra liquida, cuantificando la supresión de la actividad enzimática. La visualización ocular de los organismos incubados en la muestra a evaluar, bajo luz ultravioleta de onda larga, y contabilización de los fluorescentes y no fluorescentes en cada cámara de exposición.

41 Método rápido de toxicidad empleando Daphnia magna y KIT-TOX.
El azúcar es el sustrato marcado Las Daphnias a usar son neonatos (menores de 24 horas) sin alimentar por aproximadamente 4 horas previas al ensayo Se emplean 36 organismos: 6 celdas con 6 organismos cada celda

42 Método rápido de toxicidad empleando Daphnia magna y KIT-TOX.
Llenar cada cámara con la dilución de la muestra a analizar Someter las Daphnias por un periodo de 60 min al efecto de la muestra y también a controles negativo y positivo (dicromato 0,8 mg/L) Luego de la hora, agregar 6 gotas del sustrato IQ e incubar 15min. Bajo luz UV, se cuentan los organismos que florecen en cada cámara Si 4 o más de los 18 organismos expuestos a la muestra no florecen, el agua es tóxica para el consumo humano

43 Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna
Principio: En la prueba de toxicidad aguda también se emplean neonatos de D.magna expuestos a diferentes concentraciones de una muestra o de un tóxico durante un periodo de 48 hs Como resultado de dicha exposición se puede determinar la concentración en que la muestra produce la muerte del 50% de la población de neonatos expuestos (CL50) con un nivel de confiabilidad del 95%.

44 Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna
En vasos de precipitado de vidrio. 25 ml. 10 neonatos por vaso, por triplicado ( 30 por tratamiento) Control (agua dura reconstituida). Control positivo con una solución tóxico de referencia. dicromato de potasio (K 2Cr 2O 7) 0,8mg/L. CL50 Diluciones de la muestra: 100; 50; 25; 12,5; 6,25% Incubar 48 hs

45 Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna.
Cálculo de la CL50: Para el cálculo de la CL50 y sus respectivos límites de confianza al 95% se utiliza el método Probit, que permite estimar la CL50 ajustando los datos de mortalidad mediante una técnica de probabilidad para estimar los valores que siguen una distribución logarítmica de tolerancias

46 Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna
Aceptabilidad de los resultados: La mortalidad en el control negativo no debe exceder el 10%. La concentración final de oxígeno disuelto debe ser mayor de 2 mg/l. La CL50 para el tóxico de referencia deberá estar dentro de los límites de confianza preestablecidos en la carta control En caso de emplear un control positivo de CL50, los valores de mortalidad obtenidos deberán encontrarse cercanos al 50%.( entre 33% y 57%)

47 Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna

48 Ensayo de toxicidad crónica con Daphnia magna
Si un test de toxicidad aguda no detecta efecto alguno de mortandad o inmovilización, esto no siempre significa que el agua analizada no contenga sustancia alguna capaz de producir otro tipo de daño Para estos casos se utilizan los tests de toxicidad crónica en los que la evaluación se basa en la capacidad reproductiva o el crecimiento de los individuos

49 Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)
Principio: El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa L) es una prueba estática de toxicidad aguda (120 hs de exposición) en la que se pueden evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento

50 Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)
La evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.

51 Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)
A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinación, pero que sin embargo, pueden retardar o inhibir completamente los procesos de elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de acción del compuesto.

52 Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)
En cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro. • Saturar el papel de filtro con 4 mL de la dilución evitando que se formen bolsas de aire. • Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente veinte semillas, dejando espacio suficiente entre ellas para permitir la elongación de las raíces. • Tapar las cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas para evitar la pérdida de humedad. Dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad para que se produzca la germinación, las cajas de Petri deben cubrirse de la luz durante el periodo de ensayo • Incubar durante 120 hs (cinco días) a una temperatura de 22± 2 °C. Realizar repeticiones para cada dilución ensayada

53 Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)
Terminado el periodo de exposición (120 h), se procede a cuantificar el efecto en la germinación y en la elongación de la radícula y del hipocotilo Registrar el número de semillas que germinaron normalmente, considerando como criterio de germinación la aparición visible de la radícula Utilizando una regla o papel milimetrado, medir cuidadosamente la longitud de la radícula y del hipocotilo de cada una de las plántulas correspondientes a cada concentración de tóxico o dilución de muestra y a los controles La medida de elongación de la radícula se considera desde el nudo (región más engrosada de transición entre la radícula y el hipocotilo) hasta el ápice radicular La medida de elongación del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de inserción de los dos cotiledones

54 Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L)
Expresión de los resultados: • Promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas de cada repetición. • Porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo, con el promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación del control negativo. • Porcentaje de inhibición en la germinación.