Separación por Precipitación

Presentación del tema: "Separación por Precipitación"— Transcripción de la presentación:

1 Separación por Precipitación
Globulinas: proteínas insolubles a bajas concentraciones de sales; albúminas, solubles Solubilidad depende del pH Distribución de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos en la superficie de la proteína determina solubilidad Solvente siempre acuoso (no en membranas); puede manipularse para alterar solubilidad de las proteínas de interés: fuerza iónica, pH, solventes orgánicos miscibles, otros solutos + - Región hidrofóbica

2 Procesos de Fraccionamiento
Para concentrar una proteína en particular a partir de una mezcla compleja No hay receta universal (ensayo y error) En cada paso, la proteína total se divide en una serie de fracciones; en cada una se busca la proteína de interés mediante ensayo específico Fraccionamiento exitoso: una fracción con alta actividad específica en donde se haya aumentado la pureza de la muestra Rendimiento: Unidades de enzima en la fracción Unidades de enzima en prep. Original Purificación: actividad específica de fracción actividad específica original

3 Fraccionamiento por Desnaturalización
Diferente sensibilidad de las proteínas al calor Determinar a qué temperatura se desnaturaliza la proteína de interés (pérdida de actividad): Temp. crítica Remover a otras proteínas más termolábiles que la de interés Calentar muestra 5-10 ºC por debajo de Temp. Críticax min. Centrifugar para remover la desnaturalizada (efecto del sustrato) Procedimiento semejante para efecto de pH

4 Fraccionamiento por Sales
Sal más comúnmente usada: sulfato de amonio Altamente soluble en agua, muy pura, barata,no tiene efecto sobre la estructura de las proteínas Después de la adición de sal, proteínas precipitadas se centrifugan y se redisuelven en buffer Proteínas solubles pueden precipitarse con una concentración mayor de la misma sal Proteína precipitada es “salted out” Sal retira la capa de moléculas de agua que rodea a la superficie de la proteína. Grupos hidrofóbicos permiten que la proteína se agregue y precipite

5 Fraccionamiento con Solventes Orgánicos
Diferente solubilidad de las proteínas en solución acuosa a solventes orgánicos: etanol, acetona, butanol Solvente: disminuye constante dieléctrica del medio  aumenta atracción entre moléculas cargadas y disminuye su interacción con el agua Solubilidad de la proteína disminuye: grupos hidrofóbicos son “protegidos” por solvente y grupos iónicos son dominantes Inverso a fraccionamiento con sales: grupos hidrofóbicos son expuestos Puede haber denaturalización y se pierde actividad

6 Fraccionamiento con Sales
Proteínas están concentradas en la célula (40%) Concentraciones iónicas 0.15 – 0.2 M, pH neutro Cuando se extraen condiciones cambian. + repulsión + - atracción

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8 log (solubilidad) = A – m(concentración de sal)
parche hidrofóbico en proteína log (solubilidad) = A – m(concentración de sal) A = constante dependiente de temperatura y pH m = constante independiente de temperatura y pH

9 Para calcular cantidad de sulfato de amonio para 1 ml de solución a 20 ºC necesario para alcanzar la concentración deseada: g = 533 (S2 – S1) 100 – 0.3S1 S1 = concentración inicial de sulfato de amonio S2 = concentración final

10 Solubilidad de algunas proteínas puras a pH 7.0 (en mg/ml)
[sulfato amonio] Proteína A m para solubilidad de 1 mg/ml (M) Aldolasa de músculo de conejo Piruvato quinasa músculo conejo GlyPi deshidrogenasa m.c Lactato deshidrogenasa m.c Fosfoglicerato mutasa m.c Albúmina sérica bovina

11 Fosforilasa Piruvato kinasa Aldolasa Lactato deshidrogenasa Enolasa Creatin quinasa Fosfoglicerato kinasa Mioquinasa Mioglobina parvalbúminas

12 Procesos de Fraccionamiento
Actividad específica: Unidades totales de enzima en la fracción Cantidad total de proteína en fracción