LA PRUEBA DEL ADN El ADN constituye el material genético de las células del cuerpo humano. Con un tipo de excepción, el ADN se encuentra exclusivamente.

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1 LA PRUEBA DEL ADN El ADN constituye el material genético de las células del cuerpo humano. Con un tipo de excepción, el ADN se encuentra exclusivamente en el núcleo de las células. En el genoma humano se estima que hay  40,000 ó más genes (trozos funcionales del DNA compuestos a su vez de 1,000 a 200,000 nucleótidos). Los nucleótidos forman un par de cadenas apareadas que toman la forma tridimensional de un doble hélix. Hay más de 3,000'000,000 de pares de bases que constituyen el genoma de una sóla célula humana. LUIS ROSSI

2 LA PRUEBA DEL ADN Cada nucleótido del ADN está compuesto de tres subunidades: una base nitrogenada, una desoxiribosa y un grupo fosfato. Hay cuatro tipo de bases nitrogenadas en los nucleótidos del ADN: timina (T), citosina (C), guanina (G) y adenina (A). Es importante resaltar que así como hay regiones con función conocida o supuesta (los genes), sucede que casi la mitad del ADN del genoma humano consiste de regiones (intrones) con función hasta hoy desconocida y que tienen una secuencia de nucleótidos repetitiva en muchos casos pero con patrones hipervariables en muchas regiones del genoma. LUIS ROSSI

3 LA PRUEBA DEL ADN Es precisamente de la hipervariabilidad (polimorfismo) de estas regiones del ADN de lo que se aprovecha para detectar diferencias (o semejanzas) entre un ser humano y otro, estudiando su ADN. Las regiones repetitivas pueden presentarse como tandas repetitivas cortas o largas. A esto se le llama VNTRs (variable number of tandem repeats) entre los que están los STR (short tandem repeats), que son las regiones hipervariables estudiadas para las pruebas modernas de paternidad. LUIS ROSSI

4 LA PRUEBA DEL ADN Toda célula nucleada contiene 46 cromosomas (excepto los gametos : los espermatozoides y los óvulos, que tiene 23 crmosomas cada uno. Los cromosomas son tan sólo la forma como la célula ordena su ADN combinándolo con proteínas. En el momento de la concepción, se necesita 46 cromosomas para procrear un nuevo ser humano. En consecuencia una persona debe recibir exactamente la mitad de su material genético de su madre biológica y exactamente la otra mitad del padre biológico. LUIS ROSSI

5 LA PRUEBA DEL ADN Está basada en un análisis exacto de los perfiles genéticos de la madre, del niño(a) y del presunto padre. Si se conocen los perfiles genéticos de la madre y de su hijo(a), el perfil genético del padre puede ser deducido con certeza casi total. Si no se hace la prueba a la madre, los perfiles del ADN del niño(a) serán comparados al perfil del ADN del presunto padre. La técnica utilizadas permiten obtener el mismo grado de exactitud (probabilidad de paternidad) en los análisis en que no se examina el ADN de la madre sino sólo el del hijo(a) y el del presunto padre. LUIS ROSSI

6 LA PRUEBA DEL ADN células epiteliales de la mejilla,
El ADN se puede extraer a partir de una variedad de muestras: células epiteliales de la mejilla, glóbulos blancos de la sangre folículos pilosos células fetales (provenientes de líquido amniótico) en cultivo semen otras muestras biológicas(tejidos, etc) LUIS ROSSI

7 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
Muestras Excelentes. Muestras Buenas o Regulares. Muestras Regulares o Malas. Muestras No aceptables. LUIS ROSSI

8 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
1. Hisopos de Muestras de la Mejilla.- Se necesita tomar muestras con dos hisopos estériles frotando vigorosamente el interior de las mejillas (un hisopo por mejilla). La idea es que de esta manera unas pocas células epiteliales puedan ser desprendidas y transferidas al hisopo. Este tipo de muestras permite resultados finales en sólo una semana. LUIS ROSSI

9 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
2. Sangre Total.- La sangre total (generalmente venosa) funciona muy bien siempre y cuando la toma haya sido hecha recientemente y colectada apropiadamente en un tubo tipo vacutainer® que contenga el preservante apropiado. La sangre que ha de ser guardada por períodos largos debe ser refrigerada. Sólo en estas condiciones la muestra de sangre puede servir tan bien como una muestra de células de mejilla. LUIS ROSSI

10 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
3. Sangre de Cordón Umbilical.- La sangre del cordón umbilical funciona muy bien si llega al laboratorio en buenas condiciones. La sangre tomada de este modo toma igual de tiempo en procesarse que la tomada en tubos vacutainer®. 4. Manchas de Sangre.- Las manchas de sangre que funcionan bien deben haberse tomado en unos papeles absorbentes que poseen unas sustancias que impiden la acción de enzimas degradantes sobre la sangre. 5. Semen.- El semen debe llegar al laboratorio congelado en tubos apropiados si es de más de 24 horas. Si es una muestra reciente basta con el condón debidamente anudado y guardado en refrigeración hasta por 24 horas. Sin embargo, procesar el ADN de estas muestras toma un poco más de tiempo. LUIS ROSSI

11 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
6. Células Fetales tomadas vía Amniocentesis.- Estas células funcionan siempre bien como fuente de ADN fetal. Sin embargo, hay que considerar que se requiere ponerlas en cultivo durante una semana antes de procesarlas. La amniocentesis consiste en insertar una aguja fina a través de la pared abdominal de la madre gestante hasta penetrar dentro del útero. Se toma una muestra del líquido en el que flota el feto y es precisamente de este líquido que posteriormente se colectan algunas células fetales de donde se extraerá el ADN. Este procedimiento toma unos 10 minutos y es realizado por el ginecólogo típicamente a partir de las 14 semanas de gestación. LUIS ROSSI

12 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
7. Células Fetales del Vello Coriónico.- Estas células también requieren ponerse en cultivo antes de ser procesadas. La muestra de vello coriónico es también un procedimiento ginecológico que se realiza aspirando una pequeña cantidad de tejido placentario primitivo (corion) mediante inserción desde la vagina. En este procedimiento se está tomando en realidad células placentarias exclusivamente pero que, puesto que son de origen fetal, corresponden exclusivamente al ADN del feto. La ventaja de esta técnica es que puede hacerse más temprano en el embarazo - típicamente a las 11 semanas. LUIS ROSSI

13 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
8. Tejido Fetal proveniente de Abortos.- El tejido fetal es una excelente fuente de ADN siempre que no se le haya expuesto previamente a la acción del formol (formaldehído al 37%). Se requiere una semana extra para procesar estas muestras. 9. Condones o Preservativos de Látex.- El semen contenido en condones sirve muy bien como fuente de ADN. Es importante que el condón se mantenga en refrigeración luego de haber sido usado. Es importante notar que del material presente en condones usados en relaciones sexuales se puede derivar hasta dos tipos de ADN (los ADN de ambos miembros de la pareja). LUIS ROSSI

14 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
10. Manchas de Semen en Ropa.- Se requiere tiempo adicional para procesar estas muestras. Se sugiere refrigerar el pedazo de ropa lo antes posible. 11. Tejidos provenientes de Exhumaciones.- Muestras exhumadas colectadas de tejido profundo del muslo o de médula ósea tomada del fémur suelen funcionar un 75% de las veces. 12. Cordón Umbilical Seco.- Muestras tomadas del cordón umbilical seco funcionan el 50% de las veces y toman hasta varias semanas adicionales para procesarse. LUIS ROSSI

15 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
13. Cepillos de Dientes.- Los cepillos dentales usados funcionan un 50% de las veces. Toman por lo menos una a dos semanas más para procesarse. 14. Basurilla de Rasuradoras Eléctricas.- La basurilla colectada del interior de las rasuradoras eléctricas puede ser una buena fuente de ADN. Estas muestras toman unas dos semanas extras para procesarse. 15. Tampones (tampax®) o toallas femeninas.- Pueden ser una excelente fuente de ADN. Hay que refrigerarlas apenas se recojan. Toman dos semanas extra para ser procesadas. LUIS ROSSI

16 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
16. Cabello Arrancado.- El cabello debería ser halado con suficiente fuerza como para desprender la raíz viva de las hebras de cabello. Se necesitaría unas 10 a 20 hebras bien tomadas para que se pueda obtener suficiente tejido. El proceso de estas muestras toma unas cuatro semanas. 17. Colillas de Cigarrillo.- Las colillas que no han estado expuestas al ambiente por mucho tiempo suelen funcionar en muchos casos. Requieren algunas semanas adicionales de proceso. LUIS ROSSI

17 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
18. Orina.- Esto es para el caso en que se requiera examinar orina para hacer una comparación entre un individuo y su orina que se hubiera usado para dosar drogas ilícitas. La orina puede funcionar bien si sucede que contiene algunas células epiteliales renales y si la muestra se tomó en un recipiente estéril que es mantenido refrigerado. Desafortunadamente, cuando la orina - tomada para dosaje de drogas - es terminada de usar, los laboratorios suelen descartarla. LUIS ROSSI

18 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
19. Tejido Incluido en Parafina.- Esta es la forma como los patólogos suelen preparar las biopsias. Estos bloques de parafina son preparados para exámenes de microscopía y no para análisis de ADN. Sin embargo, hay familiares de personas ya fallecidas que los quieren usar como manera post-mortem de determinar paternidad. El preservante típicamente usado para fijar las biopsias suele ser formol (formaldehído al 37%). El formol causa entrecruzamientos covalentes inter e intramoleculares en el ADN. El formol inclusive es capaz de entrecruzar la enzima (que usamos para amplificar el ADN) contra el mismo ADN que estamos tratando de analizar. En consecuencia, es una mala fuente de ADN y se logra resultados exitosos en sólo un 25% de los casos y tan sólo luego de hasta meses de tratativas sin la seguridad de obtener un resultado final exitoso. LUIS ROSSI

19 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
20. Papel Higiénico (o kleenex®) Usados.- Son mala fuente de ADN. Sin embargo, cuando están manchados con sangre y son transportados correctamente al laboratorio, sí funcionan con mucha frecuencia. 21. Pelo Caído.- El cabello, vello o pelo corporal caído (telogénico) constituye cabello, vello o pelo que llegó al final de su ciclo de vida y se desprende del cuerpo de manera natural. Este tipo de cabello o pelo nunca funciona como buena fuente de ADN y se encuentra típicamente en: peines, cepillos de cabello, ropa, almohadas, sábanas, rejillas de desagüe de las duchas. Asimismo, el cabello cortado no funciona como fuente de ADN. LUIS ROSSI

20 Validez de diferentes tipos de Muestra como fuentes de ADN
22. Sangre Seca (podrida).- Las muestras de sangre tomadas en tubos no estériles, sin preservantes y mantenidas a temperatura ambiente por períodos extendidos de tiempo, definitivamente no funcionan. Cualquier ADN que se pueda extraer de dichas muestras estará tan degradado que sencillamente no podremos amplificar fragmentos suficientemente grandes como para ser analizados. 23. Tejidos mantenidos en Formol.- Biopsias o tejidos colectados durante autopsias que hayan sido puestos en frascos con formol definitivamente no funcionan. 24. Cenizas Fúnebres.- Los tejidos cremados definitivamente no funcionan pues en las cenizas fúnebres no hay ADN rescatable . LUIS ROSSI

21 LA PRUEBA DEL ADN Es la prueba de máxima validez científica para determinaciones de parentesco en el mundo. La confiabilidad es tan grande como la que le merezca a usted el laboratorio al que le confía la prueba. Su resultado es contundente. Para cada persona examinada se analiza mediante la técnica STR (short tandem repeats) un total de 13 marcadores genéticos (loci de secuencias repetitivas tetraméricas) en varios cromosomas del ADN que corresponden al llamado CODIS. LUIS ROSSI

22 LA PRUEBA DEL ADN El CODIS, según las pautas del F.B.I., constituye el conjunto de marcadores del ADN que permite identificar singularmente a una persona como para que sus resultados sean comparables con el banco de datos de identificación de individuos de los EE.UU. Esta combinación especial CODIS hace que el perfil genético obtenible para un individuo arroje típicamente una probabilidad de repetición al azar en otro individuo de 1 en 1015 (ó 1 en 1,000,000,000,000,000 personas) [recordemos que en el planeta Tierra hay 5,500,000,000 humanos vivos y tan solo la cuarta parte de ellos son hombres en edad fértil.] Es entonces una prueba CONTUNDENTE. LUIS ROSSI

23 LA PRUEBA DEL ADN Técnicamente la prueba puede arrojar un resultado negativo (exclusión de paternidad ) con un 100% de certeza o uno positivo (inclusión de paternidad ) con un % de certeza. LUIS ROSSI

24 LA PRUEBA DEL ADN Aquí debemos hacer la precisión de que si no se dice 100% sino % es por razones meramente estadísticas. Hay solo dos casos teóricamente posibles en que se podría decir que alguien sí es el padre con un 100 % de certeza: a) Luego de haber hecho el análisis a TODOS LOS HOMBRES DEL PLANETA y haber descartado a los demás. b) Luego de haber analizado todos y cada uno de los 4,500 millones de nucleótidos de la molécula de ADN del padre presunto. Naturalmente, ambas proposiciones son en la práctica imposibles y un % de certeza estadística es entonces perfectamente satisfactorio. LUIS ROSSI

25 LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
Los STR (short tandem repeats) son loci (lugares del ADN) que consisten de elementos secuenciales cortos y repetitivos que fluctúan en tamaño (3 a 7 pares de bases de longitud). Estas tandas repetitivas son abundantes y están ampliamente distribuídas en el genoma (conjunto total del ADN) humano. Los STR sucede que son una fuente muy rica de marcadores muy polimórficos los cuales pueden ser detectados y amplificados mediante la técnica conocida como PCR (reacción en cadena de la polimerasa). LUIS ROSSI

26 LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
Los alelos (tipos) de estos loci se pueden diferenciar unos de otros según el número de copias de la secuencia repetitiva contenida dentro de la región previamente amplificada mediante la técnica de PCR. Para distinguir uno de otro se separan los fragmentos mediante electroforesis (migración en un campo eléctrico sobre una superficie de un gel) sobre geles de poliacrilamida capaz de distinguir los fragmentos en función de sus tamaños diferentes. Luego estos fragmentos pueden visualizarse usando detección por radiactividad, fluorescencia o coloración con sales de plata. LUIS ROSSI

27 LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
En este método se usa un método de detección por fluorescencia, que es una metodología rápida, no-radiactiva que puede usarse para evaluar muy pequeñas cantidades de ADN humano (un nanogramo, es decir, una milmillonésima de gramo de ADN). El análisis mediante el método STR es más tolerante que otros métodos cuando se usa plantillas de ADN degradadas puesto que los productos de la amplificación por PCR miden menos de 400 pares de bases en longitud, estas resultan ser mucho más pequeñas que las obtenidas mediante análisis vía AMP-FLP o VNTR. LUIS ROSSI

28 LA PRUEBA DEL ADN Método STR para la Prueba de Paternidad por ADN
Además de estas ventajas, los loci STR escogidos por este método contienen alelos de longitudes discretas y separables. Esto permite la construcción de escaleras alélicas que contienen fragmentos de las mismas longitudes que muchos de todos los alelos conocidos para cada locus. El método STR tiene un poder de discriminación de un hombre entre cada 5,180'000,000 individuos. Es importante notar que si la población mundial actual es de unos seis mil millones de personas, y suponemos que de ellos poco menos de la mitad son hombres y que de ellos sólo una fracción es una subpoblación masculina en edad fértil, pues entonces el poder de discriminación es prácticamente absoluto. LUIS ROSSI

29 LA PRUEBA DEL ADN Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
Este es un método usado aún por varios laboratorios para la determinación de paternidad por ADN. Sin embargo, es un método antiguo y - en la práctica - es tecnológicamente obsoleto. Hoy en día el método más preciso y exacto es el Método STR. Para efectos de información histórica el método RFLP consiste de: 1) El ADN es extraído de los leucocitos de la sangre. LUIS ROSSI

30 LA PRUEBA DEL ADN Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
2) El ADN de la muestra es cirtado en fragmentos, los que resultan ser de tamaños diversos, precisamente porque estos tamaños dependen de la diversidad y variabilidad genética de la muestra. El nombre RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms) significa que se usa la propiedad de las enzimas de restricción para cortar regiones específicas del ADN que sucede que son muy variables(hipervariables) de individuo a individuo(polimorfismo). 3) Los fragmentos de ADN son colocados en una superfcie gelatinosa(gel de agarosa) con el propósito de someterlos a una separación en base a su  tamaño. LUIS ROSSI

31 LA PRUEBA DEL ADN Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
4) Se sumerge el gel en una solución conductora y luego se corre la electroforesis. 5) Puesto que el gel de agarosa tiene poros, los fragmentos más pequeños de ADN migrarán hacia el ánodo(polo positivo) más rápidamente que los fragmentos de ADN más largos. 6) Los fragmentos de ADN así separados se transfieren luego por adhesividad a una membrana de nylon(Southern blott). LUIS ROSSI

32 LA PRUEBA DEL ADN Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
7) La membrana de nylon contiene ahora covalente y firmemente adheridos los fragmentos de ADN en la misma posición en que migraron sobre el gel durante el proceso de electroforesis ) Esta membrana de nylon es expuesta a sondas marcadas de ADN. Estas sondas son pequeños fragmentos sintéticos de ADN de secuencia conocida y que corresponden a zonas selectas de hipervariabilidad del ADN humano. Las sondas suelen estar marcadas con isótopos radiactivos o con sustancias fluorescentes (por tanto, emisoras de luz). LUIS ROSSI

33 LA PRUEBA DEL ADN Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
9) La membrana de nylon luego se coloca contra una película de rayos X (si se usó sondas radiactivas) o fotográfica (si se usó sondas fluorescentes), la cual luego es revelada ) Las bandas que se observan en la película revelada son típicamente así: Madre Hijo(a) Padre Supuesto #1 Padre Supuesto #2 LUIS ROSSI

34 LA PRUEBA DEL ADN Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN
En este ejemplo, el padre supuesto # 1 es el verdadero padre. A esto se le llama inclusión y a esta prueba se le asigna un Índice de Paternidad (PI) el cual se cuantifica tomando en cuenta la probabilidad (ya conocida por estudios horizontales en grupos raciales definidos) de que un fragmento (alelo) de tal tamaño aparezca en un individuo cualquiera. 11) El proceso se repite varias veces usando la misma membrana de nylon, pero exponiéndola a diversas sondas. Cada sonda identifica áreas diferentes del ADN (que mapean en regiones diferentes de diferentes cromosomas) ) Los diferentes Índices de Paternidad se multiplican entre sí (pues estadísticamente se trata de eventos que ocurren independientemente) para así calcular el llamado Índice de Paternidad Combinado (CPI) ) En base al CPI, se aplica la siguiente fórmula para calcular la Probabilidad de Paternidad (PP): PP = 1 – CPI/(CPI-1) LUIS ROSSI

35 LA PRUEBA DEL ADN Explicación de los Resultados de Paternidad
Los resultados se pueden explicar en una de 2 maneras: 1. El padre presunto es excluido como padre biológico del niño(a) El padre presunto no puede ser excluido como padre biológico del niño(a) y esto se alcanza cuando la probabilidad de paternidad es de más de 99.9% LUIS ROSSI

36 LA PRUEBA DEL ADN Explicación de los Resultados de Paternidad
Los resultados luego detallan los patrones del ADN de los individuos a quienes se ha sometido a prueba. Todos los seres humanos tienen dos marcadores genéticos (ó "cifras" para efectos de esta explicación), para CADA sistema de ADN analizado. Un marcador genético fue heredado de la madre y el otro marcador genético obligatoriamente fue heredado de su padre biológico. LUIS ROSSI

37 LA PRUEBA DEL ADN Explicación de los Resultados de Paternidad
Ejemplo de Exclusión.- Sistema Madre Hijo Padre Presunto Índice de Paternidad D9S 9q Puesto que tanto la madre como el hijo ambos tienen el marcador genético "33", conocemos que el hijo heredó el "33" de su madre. Por tanto, obligatoriamente el marcador genético "32" DEBE haber sido heredado de su padre biológico. Entonces, observando la cuarta columna veamos los marcadores genéticos del padre presunto: Él no tiene un "32"; en consecuencia, él no puede ser el padre biológico. El índice de paternidad para este sistema es 0.00 y, por tanto, este sistema lo excluye como el padre verdadero. LUIS ROSSI

38 LA PRUEBA DEL ADN Explicación de los Resultados de Paternidad
Ejemplo de Inclusión.- Sistema Madre Hijo Padre Presunto Índice de Paternidad D9S 9q La madre contribuyó el marcador genético "33" a su hijo. Por tanto, obligatoriamente el marcador genético "30" DEBE haber sido heredado de su padre biológico. Entonces, observando la cuarta columna veamos los marcadores genéticos del padre presunto: Él sí tiene un "30"; en consecuencia, él ADN en este sistema sí cuadra y, por tanto el padre presunto PUEDE ser el padre verdadero. El índice de paternidad es un indicador de qué tan común es este marcador genético en la población (de su raza). Mientras más alto es el índice de paternidad, más raro es el marcador genético en dicha población. LUIS ROSSI

39 LA PRUEBA DEL ADN Explicación de los Resultados de Paternidad
Es importante resaltar que para que el padre presunto NO sea excluido, TODOS los sistemas de ADN probados deben cuadrar. Y se debe probar tantos sistemas de ADN como sean necesarios hasta obtener una Probabilidad de Paternidad mayor que 99.9% Considerando que en este caso se trata de eventos estadísticos mutuamente excluyentes, los índices de paternidad obtenidos para cada sistema se deben multiplicar entre sí … a esto se le llama el CPI (Índice de Paternidad Combinado). LUIS ROSSI

40 LA PRUEBA DEL ADN Explicación de los Resultados de Paternidad
Puesto que la Probabilidad de Paternidad es una expresión estadística del llamado Índice de Paternidad Combinado (CPI), para que la probabilidad de paternidad sea diferente que cero (y, por tanto, mayor que 99.9%), ninguno de los números en la columna de Índice de Paternidad deberá ser igual a cero. LUIS ROSSI