Mutaciones en proteínas de unión al telómero Mutaciones en la telomerasa Acortamiento del telómero DESENCADENAN SIMILARES RESPUESTAS CELULARES: Fusión.

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2 Mutaciones en proteínas de unión al telómero Mutaciones en la telomerasa Acortamiento del telómero DESENCADENAN SIMILARES RESPUESTAS CELULARES: Fusión cromosómica Arresto del ciclo celular Apoptosis dependiente de p53 DISTINTOS MECANISMOS QUE PRODUCEN DISFUNCIÓN TELOMÉRICA

3 TELOMERASA Transcriptasa inversa que añade repeticiones teloméricas al final de los cromosomas para compensar la pérdida de secuencias que se produce durante la replicación del DNA. Su ausencia provoca el acortamiento paulatino del telómero. El progresivo acortamiento desencadena la pérdida de función telomérica.

4 CONSECUENCIAS DE LA AUSENCIA DE TELOMERASA Generar especies de ratones Knock out telomerasa mTR -/- ACORTAMIENTO DE LOS TELOMEROS Blasco et al 1997

5 RATONES Knock out mTR -/- Para generar ratones deficientes en la actividad de la telomerasa se delecionó la copia del gen ARN telomerasa (mTR) de la línea germinal. Mediante Southern blot se determinó la presencia de una única copia del gen. Para delecionar el gen mTR se construyó el plásmido pPNT-mTRΔ, el que reemplazó el gen mTR completo con un gen de resistencia a la neomicina. Los ratones mTR-/- carecen de actividad detectable de la telomerasa aunque fueron viables por seis generaciones.

6 Gene Replacement and Transgenic Animals

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8 G1 G3 G6 Telomeros normales Fenotipo WT GENERACIONES DE RATONES mTR -/- (Gen de la telomerasa Knock out) Telomeros cortos Fenotipo WT Telomeros muy cortos Fusion de los extremos de los cromosomas Apoptosis de células germinales Alta tasa de infertilidad AUSENCIA DE TELOMERASA

9 OBJETIVO GENERAL Establecer si para la viabilidad celular y la estabilidad cromosómica es determinante el largo promedio de los telómeros o el acortamiento crítico de los mismos Apoptosis por una disminucion del largo promedio de los telomeros Apoptosis por un acortamiento crítico del telomero de un cromosoma

10 PRIMER EXPERIMENTO Los telómeros cortos inician la respuesta celular en mTR-/-

11 mTR -/- (G6) TELOMEROS CORTOS SIN TELOMERASA mTR +/- TELOMEROS LARGOS CON TELOMERASA mTR +/- (iF1) CON TELOMERASA mTR -/- (iF1) SIN TELOMERASA 50 % TELOMEROS CORTOS 50% TELOMEROS LARGOS 2 NUEVAS GENERACIONES

12 Apoptosis testicular Fusión de cromosomas en metafase de leucocitos Comparación de los fenotipos Peso testicular. WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL” G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL” iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos

13 G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL” iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL” G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos

14 CONCLUSIÓN La presencia de telómeros cortos es suficiente para desencadenar una respuesta celular La adición de la telomerasa rescata el fenotipo W-T

15 SEGUNDO EXPERIMENTO ¿EXISTE UNA ELONGACIÓN PREFERENCIAL DE LOS TELOMEROS CORTOS POR LA TELOMERASA EN RATONES mTR +/- (iF1)?

16 Se realiza una comparación de la distribución del largo de los telomeros en cada genotipo. WT mTR+/-, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1 mTR+/- Se utiliza la técnica de Q-Fish ( Quantitative Fluorescence in situ hybridization) para medir la cantidad de repeticiones teloméricas en cada cromosoma.

17 Q FISH El largo de los telómeros en cada genotipo está representado como una distribución de frecuencia de las intensidades de la señal (TFUs) expresadas en unidades fluorescentes arbitrarias. Es una técnica cuantitativa de hibridación in situ por fluorescencia Desnaturalizan e hibridan con una sonda CCCTAA (secuencia telomérica) marcada radiactivamente La intensidad de la fluorescencia en cada telómero es calculada desde una camara digital utilizando técnicas de análisis de imagen.

18 DISTRIBUCION DE FRECUENCIAS DE LOS TFUs Se observó un cambio significativo en la longitud promedio de los telomeros mTR +/- y los mTR -/- G3 Se observó una longitud promedio similar mTR+/- i(F1) y mTR-/- i(F1) Pero si existen diferencias significativas en el numero de repeticones teloméricas

19 CONCLUSIÓN La telomerasa restaura la función telomérica en los mTR+/- i(F1) por adición de repeticiones sobre los telómeros mas cortos Y no por elongación global

20 SE INVESTIGA EN QUE FASE DEL DESARROLLO OCURRE LA RESTAURACION DE LOS TELOMEROS Utilizan fibroblastos embrionarios (MEF) de ratones de cada genotipo para analizar: A)Extremos libres de los cromosomas (son detectados por Q-FISH como falta de señal telomérica) B) Fusión de los cromosomas C) Viabilidad de los MEF expuestos a radiación ionizante en todos los genotipos. TERCER EXPERIMENTO

21 MÉTODO Toman 5 embriones de 13 días de cada genotipo Analizan 20 metafases de MEF en cada uno de los embriones Sacan el Nº promedio de extremos libres y de cromosomas fusionados para cada genotipo WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1mTR+/-

22 Análisis de las señales libres en los extremos cromosómicos El número de extremos libres en MFEs mTR-/- iF1 es significantemente más elevado que en mTR+/- iF1 F1i mTR-/- muestra un promedio de 1.34 cromosomas sin repeticiones telomericas. F1i mTR+/- muestra solo un promedio de 0.02 cromosomas sin repeticiones. EXTREMOS LIBRES EN LOS CROMOSOMAS (Q-FISH)

23 FUSIONES CROMOSOMICAS Análisis Citogenético de mTR+/- iF1 y de mTR-/- iF1. mTR -/- iF1 presenta 0,27 cromosomas fusionados por metafase mTR+/- iF1 no presenta extremos fusionados. Del análisis de las señales libres en los extremos cromosómicos y citogenético llevado adelante en cepas de diferente edad para los genotipos mTR+/- iF1 y mTR-/- iF1 se puede concluir que la restauración de la función de los telómeros ocurre antes del día13,5 del desarrollo.

24 Método para estudiar la viabilidad de los MEF despues de exponerlos a radiación ionizante WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1 mTR+/- Toman 3 embriones de cada genotipo De cada embrion se obtienen 2 cultivos independientes de MEF Sin Irradiar Se expone a dosis crecientes de radiación ionzante Calculan el porcentaje de viabilidad

25 RESULTADO Mientras que el WY, mTR-/- G3 y mTR+/- iF1 MFEs muestran niveles similares de daño en su crecimiento, mTR -/- iF1 MFEs y mTR-/- G6 sufren una significativa reducción en la supervivencia celular Existe una íntima relación entre la long de los telómeros y la sensibilidad a la RI. Los telómeros cortos presentan una menor supervivencia frente a radiaciones ionizantes.

26 CONCLUSIÓN La función de los telómeros ocurre antes del día 13,5 del desarrollo. Los telómeros cortos presentan una menor supervivencia frente a radiaciones ionizantes

27 Distribución no al azar de fusiones cromosómicas CUARTO EXPERIMENTO Generan dos líneas independientes de ratones Knock Out mTR -/- LÍNEA 1 14 individuos y se analizan 26 metafases de esplenocitos LÍNEA 2 11 individuos y examinan 54 metafases

28 LÍNEA 1 14 individuos y se analizan 26 metafases de esplenocitos 1)Identificar especificamente los cromosomas que estan implicados en las fusiones ( SKY)

29 Línea 1: Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados.

30 CONCLUSIÓN No hubo una fusión en particular que fuera vista en todas las metafases de un ratón dado, indicando que las fusiones ocurrieron de novo y no fueron heredados de una generación previa Las fusiones son generalmente en los brazos p En esta linea los cromosomas mas frecuentemente involucrados en fusiones son el 19 y el 5

31 QUINTO EXPERIMENTO Chromosomes Frequently Involved in Fusions Have the Shortest Telomeres

32 Objetivo: Determinar si la presencia de telómeros cortos esta relacionado con los eventos de fusión cromosómica. Se analizan esplenocitos de ratones mTR-/- (sin telomerasa), de generaciones tardías G4-G6 (mayor frecuencia de fusiones)

33 Cromosomas analizados mediante QFISH Ratones Wild –Type analizados muestran una señal en cada extremo telomérico. Ratones Wild –Type analizados muestran una señal en cada extremo telomérico. Ratones mTR-/- (G4-G6), muestran un número aumentado de cromosomas sin señal detectable. Ratones mTR-/- (G4-G6), muestran un número aumentado de cromosomas sin señal detectable.

34 Análisis de cromosomas mediante SKY Fish (spectral karyotyping). Utiliza combinación de 24 sondas coloreadas, y fluorocromos distinguibles por espectro de color. Utiliza combinación de 24 sondas coloreadas, y fluorocromos distinguibles por espectro de color. Se obtienen diferentes combinaciones de color por Se obtienen diferentes combinaciones de color por La mezcla de diferenctes fluorocromos. La mezcla de diferenctes fluorocromos. Asigna a cada cromosoma un color específico. Asigna a cada cromosoma un color específico.

35 En este caso identifica qué cromosoma perdió su señal telomérica

36 Resultados Cromosoma 19 perdió la señal telomérica en 9/9 ratones examinados. Cromosoma 19 perdió la señal telomérica en 9/9 ratones examinados. Cromosoma 5 perdió su señal en 7/9 ratones examinados. Cromosoma 5 perdió su señal en 7/9 ratones examinados. Análisis estadístico para establecer la aparente relación entre cromosomas sin señal de telómero y eventos de fusión. Análisis estadístico para establecer la aparente relación entre cromosomas sin señal de telómero y eventos de fusión. (en comparacion con probabilidad de que cada cromosoma se involucre en evento de fusion al azar).= cromosomas sin señal telomerica tienen mayor probabilidad de evento de fusión. (en comparacion con probabilidad de que cada cromosoma se involucre en evento de fusion al azar).= cromosomas sin señal telomerica tienen mayor probabilidad de evento de fusión.

37 CONCLUSIÓN Cromosomas con telómeros muy cortos Cromosomas con telómeros muy cortos ( que perdieron la señal telomérica), son los más propensos a sufrir fusión.

38 Análisis de las fusiones cromosómicas que causan disfunción telomérica. SEXTO EXPERIMENTO

39 Analizan la secuencia nucleotídica que comprende la fusion de los cromosomas Clonaron y secuenciaron empalmes de fusión. Realizan una PCR utilizando primers que hibridan con las secuencias de los minisatélites Amplifican DNA de esplenocitos de ratones WT y mTR -/- (G5 y G6) El ensayo en WT no genera producto Se generan bandas específicas Secuencian el producto de PCR El amplicón está compuesto sólo por repeticiones de los minisatélites

40 Utilizan Q-FISH dirigido a los minisatélites para determinar si todas las fusiones se originaban por mecanismos similares Secuencia amplificada por PCR Analizan 30 metafases de 2 ratones

41 Conclusiones Las fusiones se producen directamente en los minisatélites mediante mecanismos NHEJ (non- homologous end joining). Las fusiones se producen directamente en los minisatélites mediante mecanismos NHEJ (non- homologous end joining). Las fusiones no contienen repeticiones teloméricas. Las fusiones no contienen repeticiones teloméricas. Todas las fusiones mostraron una disminución en la intensidad de la señal en relación al valor promedio del total de las señales normales (Rango= 2,5%-55%). Todas las fusiones mostraron una disminución en la intensidad de la señal en relación al valor promedio del total de las señales normales (Rango= 2,5%-55%). El promedio de disminución de la señal fue del 21%. El promedio de disminución de la señal fue del 21%. Esta pérdida de secuencias en los minisatélites sugiere la ausencia de regiones teloméricas en estas uniones. Esta pérdida de secuencias en los minisatélites sugiere la ausencia de regiones teloméricas en estas uniones.

42 SÉPTIMO EXPERIMENTO UNA LÍNEA (LÍNEA 2) M TR -/- INDEPENDIENTE TIENE DISTINTOS CROMOSOMAS CON TELÓMEROS CORTOS Y DIFERENTES CROMOSOMAS FUSIONADOS.

43 Objetivo Observar si el evento fundador de un clon, contribuye con la distribución no al azar de telómeros cortos (C) Frecuencia de fusiones en cada cromosoma de la línea 2 de ratones. (SKY) (D) Frecuencia de señal de extremos de cromosomas libres en cada cromosoma de la línea 2 (Q-FISH) Visualizamos la distribución no al azar de fusiones y se observa que: Los cromosomas fusionados eran más frecuentemente los que tenían telómeros cortos, sin embargo, la identidad de éstos era distinta a los de la línea 1 de ratones.

44  No existe ningún cromosoma en particular que presente los telómeros mas cortos o mas largos en los ratones examinados CONCLUSIÓN

45 OCTAVO EXPERIMENTO ¿EL LARGO TELOMÉRICO EN RATONE W-T ES CARACTERISTICO DE CADA CROMOSOMA? Este análisis pretende establecer si alguna distribución telomérica es significativamente mas corto o mas larga que las otras distribuciones teloméricas

46 OBJETIVO Determinar la distribución del largo de los telómeros en cada cromosoma de ratones W- T utilizando la técnica de SKY y Q Fish. Los datos son analizados por un método estadísitco

47 METODO Toman 5 ratones Wild Type Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e identifican a cada cromosoma por SKY Es determinada la distribución del largo de los telómeros para cada cromosoma La distribución del largo de los telómeros en cada brazo del cromosoma fue comparado con la distribución de todos los otros brazos de los cromosomas en cada ratón

48 No hay ningún cromosoma en particular que tenga una distribución de longitudes de telómeros más cortos o más largos en ratones WT. C) Tabla final de todos los resultados obtenidos por el test estadístico Wilcoxan rank sum De los 5 ratones nombrados como A, B, C, D y E. Los círculos azules representan los telómeros significativamente más largos Los puntos rojos, los significativamente más cortos. Los asteríscos representan los largos de los telómeros que fueron solo escasamente significativos

49 Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma es necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en las generaciones tardías de los ratones mTR -/- Solo los cromosomas con telomeros cortos son los que están implicados en las fusiones. La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los ratones mTR +/- (F1). El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de los telómeros sino el de mantener la función telomérica en los cromosomas que presenten telómeros cortos. CONCLUSIÓN

50 CONCLUSIONES FINALES Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma es necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en las generaciones tardías de los ratones mTR -/- Solo los cromosomas con telómeros cortos son los que están implicados en las fusiones. La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los ratones mTR +/- (iF1). El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de los telómeros sino el de mantener la función telomérica en los cromosomas que presenten telómeros cortos. Dos cromosomas disfuncionales pueden sufrir degradación transitoria de sus extremos seguida de fusión cromosómica por mecanismos de NHEJ en regiones minisatelitales.

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52 Línea 1: Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados. Línea 2: Cromosoma 6 fusionado en 6 de 14 ratones. Cromosoma 19 fusionado en 3 de 14 ratones. Cromosoma 5 no presenta fusión.

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54 LÍNEA 1 14 individuos y se analizan 26 metafases de esplainocitos LÍNEA 2 11 individuos y examinan 54 metafases 1) Identificar especificamente los cromosomas que estan implicados en las fusiones ( SKY) 2) Analizar si la presencia de telomeros cortos está correlacionada con la fusión de los cromosomas (Q- FISH)

55 Metafase analizada por la técnica SKY Metafase analizada por la técnica DAPI Identificacion de cromosomas fusionados

56 Metafase analizada por la tecnica Q-FISH Metafase analizada por la tecnica SKY Identificación de cromosomas con extremos libres Pérdida de la señal telomérica Control: analizan un Wild Type y ven que muestra una señal en cada extremo del cromosoma Observación: Las mTR -/- van incrementando el Nº de cromosomas que no presentan señal en sus extremos al incrementar las generaciones. Los cromosomas implicados en fusiones presentan frecuentemente telomeros cortos

57 ¿El largo de los telómeros en ratones Wild Type es característico de cada cromosoma? EXPERIMENTO CONTROL EXPERIMENTO CONTROL Hipótesis: Cada cromosoma tiene una distribución del largo de los telómeros y en cada evento de fertilización se establece una nueva distribución. Este análisis establece si alguna distribución telomérica es significativamente más corta o más larga que las otras distribuciones teloméricas

58 Determinan la distribución del largo de los telómeros en cada cromosoma de ratones Wild Type utilizando la técnica de SKY y Q-FISH. Los datos son analizados por el metodo Wilcoxon´s Rank Sum (programa estadístico). METODO Toman 5 ratones Wild Type Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e identifican a cada cromosoma por SKY Es determinada la distribución del largo de los telómeros para cada cromosoma La distribución del largo de los telómeros en cada brazo del cromosoma fue comparado con la distribución de todos los otros brazos de los cromosomas en cada ratón

59 La identidad de los cromosomas que carecen de señal telomérica se corresponde con la identidad de los cromosomas implicados en fusiones La identidad de los cromosomas difiere en las 2 líneas

60 Representa una distribución significativa de los telomeros mas largos Representa una distribución significativa de los telomeros mas cortos

61 No existe ningun cromosoma en particular que presente los telómeros más cortos o más largos en los ratones examinados.