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Publicada porEsmerelda Carrasco Modificado hace 9 años
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Transformación Bacteriana Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa) Transformación Bacteriana Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
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pGLO™ & GFP
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Dogma Central de la Biología Molecular
ADN ARN Proteína Característica
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Conexiones con el mundo real
GFP es un marcador visual Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas) Localización y regulación de la expresión de un gen Movimiento celular El destino celular durante el desarrollo Formación de los diferentes órganos Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos
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Scientists use GFP as a Tracer
Proteínas Híbridas Fluorescentes
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Procedimiento de Transformación
Day 1 Day 2
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Temas Cubiertos Introducción
Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína
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Kit de Transformación de Bacteria con plásmido pGLO™
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¿Qué es una Transformación?
Alteracion de una Bacteria como resultado de la incorporación de ADN exógeno (que viene de afuera de la célula). Frecuentemente, el ADN es circular y llamado plásmido. GFP bacteria b-Lactamasa Confiere Resistencia al Antibiótico Ampicilina. plásmidos
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¿Qué es un plásmido? Un pedazo circular de ADN de doble cadena, que se replica autónomamente. Fue evolucionado originalmente en bacterias. Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado para expresar una proteína de interés.
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Las diferentes caras de un plásmido
Micrografía de transmisión de electrones Gel de agarosa Representación Grafica
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Plásmido pGLO Beta-Lactamasa
Confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Proteína Verde Fluorescente (“Green Fluorescent Protein, GFP”) Aequorea victoria, gen de medusa araC: Regulador Regula la transcripción de GFP
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Transformación con pGLO
Pared celular GFP Bacteria Cromosoma Bacteriano (ADN) Beta-Lactamasa (resistencia a ampicilina) Plásmidos de pGLO
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ADN Bacteriano Célula de Bacteria Plásmido de ADN ADN Geonómico
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Regulación de Transcripción
Operón de lactosa Operón de Arabinosa Plásmidos de pGLO
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Regulación de Transcripción
Operón lac Operón ara LacI araC B A D Z Y A Efector (Arabinosa) Efector (Lactosa) araC B A D LacI Z Y A ARN Polimerasa ARN Polimerasa araC Z Y A araC B A D
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Regulación de la expresión del gen
Operón ara Operón GFP araC B A D araC Gen de GFP Efector (Arabinosa) Efector (Arabinosa) araC B A D araC Gen de GFP ARN Polimerasa ARN Polimerasa araC araC B A D araC araC Gen de GFP
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Métodos de Transformación
Electroporación Un choque eléctrico resulta en que la célula sea permeable al plásmido ADN Cloruro de Calcio y Choque Térmico Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico
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Proceso de Transformacion
Suspender las colonias en la Solución de Transformación. Añadir el plásmido pGLO ADN. Incubar los tubos en hielo por 10 minutos. Choque térmico a 42°C por exactamente 50 segundos, y luego colocar en hielo por 2 minutos. Añadir el caldo nutriente LB e incubar a temperatura ambiente. Esparcir 100 mL de la suspensión por la superficie de las placas de agar.
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¿Que es el caldo nutriente de LB?
Caldo Luria-Bertani (LB) Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés. carbohidratos aminoácidos nucleótidos sales vitaminas
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Medida de Volumen en los Goteros Plásticas
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Importancia de cada paso de la transformación
Base O O CH2 La solución de transformación contiene CaCI2 . La carga positiva del los iones de Ca2+ neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN. Azúcar O Ca++ O P O Base O O CH2 Azúcar OH
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Importancia de cada paso de la transformación
Pared Celular GFP 2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular. 3. Choque térmico -incrementa la permeabilidad de la membrana celular. 4. La recuperación con LB permite la expresión de la beta-lactamasa. Beta-Lactamasa (resistencia a ampicilina)
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¿Crecer? ¿Brillar? Siga el protocolo ¿En qué placas crecerán colonias?
¿Qué colonias brillarán? LB/Amp LB/Amp/Ara LB
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¿Qué observó en las placas de agar?
Crecimiento de colonias que no brillan. Crecimiento de colonias que sí brillan. Ningún Crecimiento de Bacterias. Crecimiento en área completa.
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