Mecanismos de transmisión hereditaria

Presentación del tema: "Mecanismos de transmisión hereditaria"— Transcripción de la presentación:

1 Mecanismos de transmisión hereditaria
Mayo 27, 2008 José L. Badano, Ph.D.

2 Categorías de enfermedades humanas
Monogénicas Multifactoriales

3 Los modelos o clasificaciones por lo general representan una simplificación de la realidad
Facilitan el entendimiento y comprensión del problema Facilitan su estudio Facilitan su disección La clave está en no perder de vista que se trata de un modelo - no interpretar los datos exclusivamente bajo ese modelo - adecuar el modelo cuando los datos “no encajan”

4 Cuál es la base celular y molecular de estas categorías?

5 La genética desde una perspectiva molecular
- Evaluar el gen en el contexto del genoma o del organismo y no en forma aislada La genética “moderna” intenta descubrir la función de las proteínas y las vías en las que participa La genética es el estudio de cómo las proteínas interaccionan y funcionan tanto solas como en complejos, y cuáles son las consecuencias de perturbar estos procesos

6 El tipo de mutación está asociado al mecanismo de herencia
Tipos de mutaciones desde el punto de vista molecular Recesivas: como se afecta la función proteica? Dominantes: hiperactividad sobre-expresión función nueva dominantes negativos haploinsuficiencia

7 Tipos de mutaciones: “recesivas”
Muchos tipos de mutaciones pueden resultar en un fenotipo recesivo Alelos nulos: deleciones codones de terminación prematuros Pérdida de función parcial: hipomorfos

8 Pérdida de función Mutación Alterar actividad Alterar abundancia
Mutando un sitio de interacción Mutando el sitio activo de una enzima Alterar abundancia Alterando estabilidad Alterando nivel de expresión (promotores, nivel y estabilidad de ARNm) Alterar localización Mutando señales de localización mutando dominios proteicos

9 Tipos de mutaciones: “dominantes”
Por lo general resultan en la adquisición de una función no fisiológica Hiperactividad función aumentada mutación en un dominio de regulación negativa Si bien la gran mayoría de mutaciones determinan una pérdida de función (recesivas), las mutaciones dominantes son interesantes y por lo general afectan moléculas señales o componentes reguladores claves de un sistema

10 Mutaciones dominantes
Mutación Hiperactividad función aumentada aumento de afinidad mutantes constitutivamente activados Expresión constante Ectópica (en los tipos celulares incorrectos) Heterocrónicas (en el momento no adecuado; ciclo celular, desarrollo) Función nueva Neomorfos esta categoría incluye la anterior supresores RNAt especificidad alterada (por ADN, por otras proteínas) actividad enzimática alterada

11 Mutaciones dominantes
Dominante negativos forma mutante interfiere con la función de la proteína salvaje basado en la idea que las proteínas funcionan mediante su interacción con otras proteínas el fenotipo se asemeja al de una mutación hipomórfica el fenotipo debería reducirse en presencia de copias extra de proteína salvaje

12 Dominante negativo ejemplo 1
Dominante negativos tetrámero en que todas las subunidades deben ser wt para tener función wt wt wt wt Mutación: ½ monomeros son mutantes: 1/16 de los tetrámeros será wt wt M

13 Los modelos son simplificaciones
Siguiendo con el ejemplo anterior: incluso habiendo una mutación que en teoría afecte el 50% de la proteína producida la proteína mutante puede ser menos estable la proteína mutante puede tener menos afinidad por la wt feedback loops pueden llevar a producir más proteína

14 Dominante negativo ejemplo 2
en algunos casos, aumentando la producción de una proteína puede tener un efecto dominante negativo (aunque el 100% de la proteína en la célula sea wt) Complejo heterotrimérico sobreproducción de

15 Mutaciones dominantes
Haploinsuficiencia Mutación nula causa un fenotipo en presencia de la copia salvaje Por lo general afecta aquellos genes/proteínas cuyos niveles están altamente regulados (morfógenos por ejemplo) Más fácil de detectar en backgrounds que han sido sensibilizados por mutaciones que producen un fenotipo modesto

16 Monogénicas Categorías de enfermedades humanas
Uno o dos alelos “fuertes” causan el fenotipo Dominante Recesivo Ligado al X Mitocondrial

17 Simplemente Monogénicas?
PKU and hyperphenylalaninaemia. PHENYLKETONURIA - Defecto en la enzima hepatic phenylalanine hydroxylase (PAH) (Jervis GA, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 82, 514–515, 1953). - Este descubrimiento permitió el diagnóstico y tratamiento de individuos afectados - Sin embargo ~ 1% de los pacientes no respondian bien a la terapia - A su vez, existe una gran variabilidad fenotípica (incluso con igual genotipo) - defectos en el locus PAH causan la mayoría de los casos de PKU - heterogeneidad de alelos? - mutaciones en otros loci? - En 1983, se mapea y clona PAH confirmando la heterogeneidad esperada - Una década mas tarde, se descubren mutaciones en un loci que afecta la biosíntesis de Tetrahydrobiopterin (Blau N et al. Pteridines 4, 1–10, 1993) La complejidad genética en PKU es bastante mayor que la originalmente esperada

18 Las mutaciones o alelos siguen un patrón de herencia Mendeliano
Las mutaciones o alelos siguen un patrón de herencia Mendeliano. Sin embargo el fenotipo no necesariamente lo hace. En la gran mayoría de los casos, la identificación de mutaciones en un determinado locus no nos permite predecir el fenotipo que el paciente desarrollará Esto se debe a la presencia de otros factores tanto genéticos como ambientales

19 Fibrosis Quística Ejemplo de enfermedad autosómica recesiva Mutaciones en CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) (Riordan JR et al. Science 245, 1066–1073, 1989). Hipótesis: el análisis del espectro de mutaciones en CFTR permitirá establecer correlaciones genotipo-fenotipo Nuevamente, variabilidad en el fenotipo, sobre todo en lo que respecta al aspecto pulmonar de la enfermedad Otra ves demostrando las limitaciones de un modelo puramente monogénico Llevando a la identificación de genes modificadores, en este caso del componente intestinal de la enfermedad (Zielenski, J. et al. Nature Genet. 22, 128–129, 1999)

20 - A su vez, algunos pacientes con un fenotipo CF moderado no presentan mutaciones en CFTR (Groman JD et al. N. Engl. J. Med. 347, 401–407, 2002)

21 Dificultad para establecer correlaciones fenotipo-genotipo (CF, PKU, otras)
Modelos Mendelianos son muy útiles para identificar genes en estos casos pero pueden no reflejar la base celular y molecular de una enfermedad Un gran número de enfermedades “monogénicas” son más complejas de lo esperado

22 Son estas enfermedades monogénicas complejas en realidad multifactoriales?
Muchos alelos contribuyen % del defecto Predisposición (contribuidores causales) Moduladores del “age of onset” (modificadores) Moduladores de la severidad (modificadores) Componente ambiental significativo

23 Herencia multifactorial
Herencia monogénica Herencia multifactorial Uno o dos alelos “fuertes” causan el fenotipo Varios alelos y el ambiente contribuyen en el fenotipo Herencia oligogénica

24 Categoría “intermedia”: enfermedades oligogénicas
Mutaciones en un número reducido de genes contribuyen al fenotipo Efecto puede se aditivo o multiplicativo Efecto puede se tanto causal como modificador

25 Características de una enfermedad oligogénica:
- siguen siendo primariamente de origen genético - requieren de la interacción de mutaciones en un número “limitado” de genes

26 Gradiente entre enfermedades Mendelianas y complejas
Donde se ubique una determinada enfermedad dependerá de: la existencia de un locus principal (CFTR) el número de loci involucrados la contribución de cada uno de ellos al fenotipo el impacto ambiental

27 CF estaría a la “izquierda” de esa curva (un gen mayor + modificadores)
Schizophrenia podría estar en el “medio” predispocisión genética significativa (40–50% concordancia en estudios de gemelos) A la “derecha” podrían estar rasgos que afectan por ejemplo el comportamiento base genética poco conocida y cuantificable

28 Modelos oligogénicos - A pesar de la participación de varios genes, los modelos mendelianos han sido instrumentales en el clonado de genes involucrados - Como se puede reconocer la “oligogenicidad”? correlaciones genotipo-fenotipo (o falta de…) diferencias genotípicas en modelos animales (diferentes backgrounds) identificación de mutaciones que no se ajustan a un modelo monogénico establecimiento de ligamiento a más de un locus o la inhabilidad de detectar ligamiento

29 Correlación genotipo-fenotipo
Se clona un gen para una enfermedad: espectro de mutaciones correlación entre tipos y mutaciones particulares con aspectos del fenotipo Frecuentemente este tipo de estudio no arroja datos significativos Entonces se expande el modelo para tomar en cuenta otros factores Ejemplos incluyen un gran número de enfermedades genéticas: - PKU - CF - familial amyotrophic lateral sclerosis (FALS) - defecto neurológico - transmitido en forma dominante

30 Ejemplo: FALS - La madre, hijo e hija segregan la misma mutación en SOD1 (V148G) Expresividad variable El hijo, más severamente afectado, es también homocigota para una mutación nula en ciliary neurotrophic factor (CNTF) CNTF sería (sólo una familia) un modificador de FALS

31 En el año 1994: Mutaciones en CNTF han sido reportadas en pacientes Japoneses con varios problemas neurológicos pero como no estaban de acuerdo con un modelo de transmisión mendeliano, se concluyó que no eran causantes del fenotipo

32 2) Diferencias fenotípicas en modelos animales
Análisis de mutaciones en un background genético homogéneo Herramienta clave para la identificación de modificadores Ejemplo: FAMILIAL ADENOMATOUS POLYPOSIS (FAP) causada por mutaciones en “adenomatous polyposis coli” (APC) Mutagénesis screen (ENU) deriva en el ratón Min (multiple intestinal neoplasia), causado por una mutación en Apc El fenotipo sin embargo es modulado por un segundo locus: Mom1 (modifier of Min)

33 3) Identificación de mutaciones que no se ajustan a un modelo monogénico
En muchos casos, la oligogenicidad se ha descubierto por azar Ejemplo: RETINITIS PIGMENTOSA (RP), una enfermedad genética y clínicamente heterogénea que puede ser heredada como autosómica dominante, recesiva o ligada al X Primer modelo ejemplificando como la expansión de modelos teóricos resuelve datos mutacionales contradictorios Modelo “digénico” Kajiwara et al. demostraron que en algunas familias se requieren mutaciones en retinal outer segment membrane protein 1 (ROM1) y peripherin/retinal degeneration slow (RDS)

34 Un modelo de enfermedad oligogénica es el Síndrome de Bardet-Biedl
Degeneración de retina Polidactilia Otras características: Obesidad Retardo Mental Dificultades de aprendizaje Malformaciones de gónadas y renales

35 Genéticamente heterogéneo:
14 BBS genes mapeados (BBS1-12, MKS1, CEP290) Históricamente considerado un ejemplo de enfermedad autosómica recesiva

36 Existe interacción entre los distintos genes de BBS
NFB14-BBS6 wt A242S 02 01 04 03 NFB14-BBS2 02 01 04 03 wt Y24X wt Y37C 02 01 06 AR237-BBS6 03 04 05 AR237-BBS2 02 01 06 03 04 05 N70S wt Katsanis et al, Science 293: (2001)

37 Herencia Trialélica En algunas familias, tres mutaciones son necesarias para desarrollar la patología 02 01 AR259- BBS6 03 04 05 Q147X wt BBS2 Y24X Q59X Katsanis et al, Science 293: (2001)

38 Análisis de la herencia trialélica
- Usando uno de los genes más prevalentes, BBS1, y analizando 259 familias con BBS: - Aproximadamente el 25% del las familias con BBS1, no encaja con un modelo de herencia mendeliano - El modelo oligogénico tiene tres predicciones básicas: 1) habrá pacientes con mutaciones en más de un gen de BBS 2) habrá no afectados con dos mutaciones en un gen de BBS 3) la frecuencia de las mutaciones “trialélicas” en la población general deberá ser más alta que la esperada en un modelo autosómico recesivo

39 1. Pacientes con mutaciones en más de un gen de BBS
PB056-BBS1 PYGM SNP1 BBS1 SNP2 DS112371 DS114960 118 A M390R C 212 247 G T 200 251 124 196 259 PB056-BBS4 M472V wt 01 02 Beales, Badano et al, Am. J. Hum. Genet.72: (2003)

40 1. Pacientes con mutaciones en más de un gen de BBS
AR241-BBS1 AR241-BBS2 01 02 01 02 03 04 05 06 03 04 05 06 M390R wt M390R wt IVSx2 wt IVSx2 wt R315Q R315Q R315Q R315Q Beales, Badano et al, Am. J. Hum. Genet.72: (2003)

41 2. habrá no afectados con dos mutaciones en un gen de BBS
PB006-BBS1 PB029-BBS1 01 02 01 02 M390R M390R M390R wt M390R M390R M390R wt 03 04 03 04 M390R M390R M390R M390R M390R M390R M390R M390R Beales, Badano et al, Am. J. Hum. Genet.72: (2003)

42 3. La frecuencia de las mutaciones “trialélicas” en la población general deberá ser más alta que la esperada en un modelo autosómico recesivo - Para BBS1 (y usando la mutación más común en este gen, M390R): - 10% de los pacientes son homozigotas para M390R y la prevalencia de BBS se estima sea de 1:100,000 Entonces: Se espera 1/1100 portadores Encontramos 2/658 Entonces, o la frecuencia de BBS 1:10,000 o una fracción importante de M390R presenta penetración reducida

43 La prevalencia de patrones complejos es diferente para cada gen de BBS
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% BBS1 BBS2 BBS4 BBS6 BBS7 1 Mut 1 Mut + 2 2 Muts + 1 Recessive BBS2-BBS1 BBS1-BBS4 BBS1-BBS6 BBS7-BBS1 BBS2-BBS4 2 BBS2-BBS6 1 4 2 1 1 Beales, Badano et al, Am. J. Hum. Genet.72: (2003)

44 El gen involucrado y el tipo de mutación determinan la carga mutacional necesaria para presentar el fenotipo Distribution of Triallelic Mutations 1 2 5 N/N/N N/N/M M/M/M N/M/M M/M/U M/S/M

45 Una característica de gran parte de las enfermedades genéticas humanas es la gran variabilidad fenotípica (tanto inter- como intra-familiar) En el ejemplo de BBS: Hipótesis: la carga mutacional puede explicar, por lo menos en parte, la variabilidad intrafamiliar observada en BBS

46 Como “medir” la contribución genética en la variabilidad fenotípica?
Problemas en este tipo de estudios: Número reducido de familias en muchos casos Evidencia de que los distintos alelos encontrados sean realmente patogénicos Dado que la variabilidad intrafamiliar es significativa (por lo menos en BBS), se dificulta cuantificar el efecto de un alelo?

47 - Identificamos tres familias con individuos afectados portanto dos o tres mutaciones en un mismo pedigree AR768- BBS1 AR768- BBS6 01 02 01 02 M390R wt wt wt T325P wt wt wt wt wt wt fs 03 04 wt wt T325P wt 03 04 M390R wt M390R wt wt fs wt fs No obesity Mild RP No MR Nml devel Nml speech Nml teeth Obese from age 1=90th centile RP/maculopathy MR Dev. delay Speech pathology/delay Crowded teeth Badano et al, Hum. Mol. Genet.12: (2003)

48 - La alteración T325P probablemente afecte la función proteica
Badano et al, Hum Mol Genet 12: (2003)

49 Herencia Trialélica En algunas familias, el número de mutaciones se correlaciona con la severidad del síndrome PB009-BBS1 9.4 9.5 9.1 9.2 9.3 M390R PB009-BBS2 L349W wt Severe RP No RP Mild SNB Badano et al, Hum. Mol. Genet.12: (2003)

50 Es la variabilidad en PB009, típica de BBS?
Edad de diagnóstico de retinopatía: paciente 03: 20 paciente 04: 15 paciente 05: 34 Badano et al, Hum. Mol. Genet.12: (2003)

51 Cuál es la variabilidad intrafamiliar en la retinopatía causada por la mutación M390R en BBS1?
- Cuál es la variación en la edad diagnóstico en familias con BBS “recesivo” y por lo menos un alelo M390R (n=10)? La diferencia es de 2.3 años con un SD de 1.7 En PB009: La diferencia en edad al diagnóstico entre -03 y -04 es 5 years (normal) La diferencia para -05 es de 14 y 19 años con -03 y -04 respectivamente Entonces PB009 muestra una variación aumentada (P<0.014) Badano et al, Hum. Mol. Genet.12: (2003)

52 Modelo gradiente par alelos oligegénicos
Badano et al, Hum Mol Genet 12: (2003)

53 Parte II Cuál es la base celular de la interacción genética observada en enfermedades oligogénicas (y complejas)?

54 Modelos de oligogenicidad
1) Modelo de rescate de vía Badano and Katsanis, Nature Rev Genet 3: (2002)

55 Modelos de oligogenicidad
2) Complejo proteico Badano and Katsanis, Nature Rev Genet 3: (2002)

56 Modelos de oligogenicidad
3) Poison Model Badano and Katsanis, Nature Rev Genet 3: (2002)

57 Como encaja BBS en estos modelos?

58 Redundancia en el sistema:
- muchas de las proteínas de BBS forman complejos - comparten interactores IP with Myc Probed: HA KDa 71 42 31 Myc(ev)/HA-BBS4 Myc-BBS2/HA-BBS4 BBS4 y BBS8 interactúan con PCM1

59 Es probable que la interdependencia de las proteínas de BBS sea una cuestión de dosis en un sistema redundante Mutación #2 BBS6/BBS1 citoplasma BBS7 PCM1 material pericentriolar BBS4 PCM1 MGC Mutación #1 BBS8 Mutaciones adicionales

60 Como usar la información celular, bioquímica, y funcional para continuar disecando la genética?

61 Continuando con el ejemplo de BBS:
- 14 genes identificados hasta la fecha - análisis de la secuencia de amino ácidos de las proteínas codificadas no brinda pistas acerca de función (proteínas de función desconocida) - se ha comenzado a disecar la función de estas proteínas mediante enfoques multidisciplinarios (biología celular, bioquímica, modelos animales, y observaciones en pacientes)

62 Un mal funcionamiento de las cilias es el defecto responsable de BBS
Ansley et al, Nature. 425: (2003) Kim et al, Nat Genet. 36: (2004)

63 El conocer la función celular afectada en una patología permite:
1) Entender la base celular y molecular de los fenotipos observados Poliquistosis renal Defectos de simetría (Situs inversus) Degeneración de retina Infertilidad

64 El conocer la función celular afectada en una patología permite:
2) Facilitar la elección de candidatos en estudios genéticos clásicos El proteoma ciliar:

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67 El conocer la función celular afectada en una patología permite: 3) Desarrollar ensayos bioquímicos que pueden proveer nuevos candidatos (tanto genes causales como modificadores) Basado en los modelos de oligogenicidad, proteínas que interactúen físicamente con nuestras proteínas de interés o que actúen en vías y/o funciones similares, serán nuevos candidatos

68 De vuelta a la genética en BBS
La interacción entre los diferentes genes de BBS no puede explicar toda la variabilidad fenotípica observada en este síndrome Existen factores ambientales y otros factores genéticos que dado su baja prevalencia y contribución al fenotipo, están por debajo del límite de resolución de la “genética clásica” Podemos usar la información acerca de la función de estas proteínas, los complejos en los que participan y los procesos celulares afectados para facilitar la identificación de estos factores genéticos?

69 Yeast two-hybrid screens: ~ 60 putative interactors
Hipótesis: genes que codifiquen proteínas en la “vía de BBS” serán candidatos fuertes a contribuir alelos ya sea causales o modificadores de la enfermedad Li et al, Cell 117: (2004) Yeast two-hybrid screens: ~ 60 putative interactors MGC1203

70 Esta proteína nueva interactúa con muchas de las proteínas de BBS
Yeast two-hybrid Co-immunoprecipitations *

71 MGC1203 se localiza en centrosomas/cuerpos basales y co-localiza con las proteínas de BBS
En IMCD3

72 Pregunta: mutaciones en MGC1203 contribuyen al fenotipo de BBS?
Secuenciamos dos colecciones independientes de pacientes de BBS identificando algunas variantes Especialmente interesante fue una C->T en la posición 430 (penúltima base del exon 3) Presente en 14 de 226 pacientes (6.2%) pero solo 4 de 274 controles (1.4%) (Fisher’s exact test P<0.006) TDT: En 27 tríos, el alelo 430T fue transmitido a los pacientes en 20 (desvío significativo de la distribución esperada 50:50, P=0.007) Estos datos apoyan la hipótesis de que variantes en MGC1203 contribuyen al síndrome de BBS.

73 Es el alelo 430T de MGC1203 patogénico?
Cambio silencioso en la penúltima base del exón 3: quizás defecto en splicing? SC35 ESE GGCCTT(C/T)G Normal …GCCAAGTTCAAGAG …..…GTCATGTCCACCCCACCCAG AGTAGGCAAA….GCA Exon 2 Exon 3 Cambio de marco de lectura y PTC Sustrato para NMD AGTAG GGCCTT(C/T)G SC35

74 Para estudiar el efecto de esta mutación:
PCR en tiempo real en líneas de pacientes con los distintos genotipos y análisis de minigene:

75 En líneas celulares de pacientes:
El nivel basal de ARNm de MGC1203 es mayor en células tratadas con emetine (inhibe NMD) Reducción del 20% en ARNm de MGC1203 en células no tratadas con genotipo 430C/T

76 Análisis de Minigene: El minigene con una “T” produce significativamente más de la forma deletada Mutagenizando el sitio e inhibiendo diferente proteínas SR (siRNA) revierte la proporción

77 Sin embargo: mutaciones en MGC1203 no serían suficientes para causar BBS
No se encontraron pacientes homocigotas para la alteración en MGC1203 Un padre no afectado es homocigota para el alelo 430T En 5 familias, el alelo 430T co-segrega con mutaciones en genes causantes de BBS

78 En un background genético sensibilizado, niveles reducidos de ARNm para MGC1203 podrían afectar tanto la penetrancia como la expresividad del síndrome - Tres familias adicionales muestran una correlación entre la presencia de la mutación en MGC1203 y una presentación clínica más severa

79 Análisis in vivo: MGC1203 interactúa genéticamente con otros genes de BBS Zebrafish

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81 Conclusiones I Identificamos MGC1203 a través de una combinación de datos bioquímicos y predicciones informáticas El cambio “silencioso” C430T aumenta splicing alternativo y aberrante Esto probablemente ocurra mediante el fortalecimiento de un ESE en el exón 3 y la utilización de un aceptor de splicing críptico en el extremo 5’ del exón, resultando en una deleción de 5 bp

82 Conclusiones II - El alelo 430T afectaría la penetrancia de BBS por lo menos en una familia, y la expresividad de la enfermedad en otras tres Este tipo de estudios muestra el poder de usar combinaciones de técnicas y modelos para detectar fenómenos genéticos

83 Ciliopatías El concepto de mutaciones en distintos genes funcionalmente relacionados resultando en el mismo fenotipo (ejemplo BBS) puede extenderse a: mutaciones en genes que participan en vías/procesos/organelos relacionados pueden resultar en entidades clínicas similares Así surge el concepto de ciliopatía que engloba distintas patologías que son consecuencia de defectos en estos organelos

84 Ciliopatías II A su vez, reconocer que determinados fenotipos son consecuencia de defectos en un organelo particular es de suma ayuda a la hora de predecir la base celular de patologías de etiología desconocida Esto a su vez puede facilitar la genética como en el ejemplo de BBS

85 El concepto de ciliopatía no sólo implica que patologías con fenotipos similares puedan compartir la misma base celular sino que a su vez, en algunos casos, mutaciones en un gen determinado pueda estar causalmente relacionado a más de una patología

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88 Resumen Los modelos son herramientas poderosas pero es importante conocer sus limitaciones Tener en cuenta que los genes y proteínas no actúan en forma aislada sino en un sistema de alta complejidad Identificar el tipo de mutaciones, la función de la proteína en cuestión y las vías en las que participa facilita el estudio a nivel genético