Realizado por: GABRIELA BASANTES LASSO SANGOLQUI, Enero del 2012

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1 Realizado por: GABRIELA BASANTES LASSO SANGOLQUI, Enero del 2012
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA COLECCION NACIONAL DE CAMOTE (Ipomoea spp.) DEL BANCO NACIONAL DE GERMOPLASMA DEL INIAP MEDIANTE MARCADORES MICROSATELITES Previa a la obtención de Título de: INGENIERA EN BIOTECNOLOGIA Realizado por: GABRIELA BASANTES LASSO SANGOLQUI, Enero del 2012

2 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote. Gabriela Basantes, 2012.

3 (Ipomoea batatas (L.) Lamarck)
El Camote (Ipomoea batatas (L.) Lamarck) Raiz reservante comestible. Importante elemento de la seguridad alimentaria. Séptimo cultivo de importancia mundial Ploidía: Hexaploide (2n = 6X = 90) Autoincompatible (alógama) o estéril. Emparentado con 13 especies silvestres. Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

4 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
Diversidad genética del camote cultivado Centros primarios de diversidad (Zhang et al., 1998). Centros secundarios de diversidad (Zhang et al., 1998). Ecuador: Perdida de 81 Ha de camote. (MAGAP, 2008) Recursos genéticos del género Ipomoea: 48 especies nativas (Jorgensen & León,1999). Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

5 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
Estudios moleculares en camote cultivado (Karuri, 2010): Análisis de la diversidad de genotipos de camote provenientes de Kenia con SSRs. (Veasey, 2008): Análisis de la diversidad de camote en comunidades de São Paulo, Brasil utilizando SSRs. (Chávez, 2001): Caracterización molecular de variedades de camote del la costa del Pacifico sur de Sudamérica con SSRs (Zhang, 2000): Análisis de la diversidad genética de variedades de camote de Latinoamérica con SSRs (Buteler, 1999): Caracterización molecular de camote y especies silvestres de Ipomoea trífida con SSRs. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

6 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
Marcadores moleculares microsatélites (A)n (AT)n (GA)n (GAA)n SSRs Altamente polimórficos Usados en la caracterización de germoplasma de camote Son más polimórficos que RAPDs, RFLPs y AFLPs. Fuente: Google Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

7 Importancia del proyecto
Estudios morfo-agronómicos Materiales promisorios Proyectos de mejoramiento genético Conservación de materiales locales y tradicionales Mejoramiento de tecnologías de cultivo Agricultores y consumidores Caracterización molecular Diferencias genéticas entre el material en estudio Relación entre materiales y estructura de la población. Evaluar la utilidad del set de marcadores SSRS de camote. Identificación de duplicados Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

8 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

9 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
OBJETIVOS General Fuente: Google Caracterizar molecularmente la colección nacional de camote así como especies silvestres del Banco Nacional de Germoplasma del INIAP mediante marcadores SSRs. Específicos 1. Caracterizar molecularmente 59 accesiones de la colección de camote y 36 accesiones de especies silvestres del B.N.G del INIAP, utilizando 12 marcadores microsatélites . 2. Comparar las diferencias genéticas presentes a nivel de polimorfismo y heterocigosidad en los genotipos de camote y especies silvestres. 3. Determinar duplicados en los genotipos de camote 4. Determinar las relaciones genéticas existentes en el germoplasma en estudio. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

10 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

11 METODOLOGIA DEL PROCESO
Extracción de ADN Fresco Material vegetal Cuantificación de ADN Extracción de ADN en seco Fuente: Google PCR con el Método M13-tailing Amplificación de SSRs Pruebas Mónoplex Pruebas PCR Pruebas Dúplex Selección de 11 loci SSRs GENOTIPAJE en el LI-COR Diseño Estadístico Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

12 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
MATERIAL VEGETAL Especies cultivadas (59) Provincia del Azuay Provincia de Napo Provincia de M. Santiago E.E Portoviejo Provincia de Orellana E.E. C. Amazonia Provincia de Manabí E.E. Sta Catalina (DENAREF) CIP Especies silvestres (30) S. sexual del B.G. I (desinfección y germinación) E.E. Sta Catalina (DENAREF) Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

13 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
MICROSATÉLITES Autor Locus Motif SSRs Tamaño (pb) Tm * (oC) Huamani (2009) IbE 27 (GAC)5GA 209 57 IbE 14 (GA)9G 200 IbE 5 (TA)5TC(TA)3TT (TA)5CA(TA)2T(TA)10 220 60 IbY 46 (ATC)5AT 144 55 Hu (2004) IBSSR 27 (TA)6(CA)16(TA)3 180 IBSSR 04 (GA)11 216 Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

14 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
MICROSATÉLITES Autor Locus Motif SSRs Tamaño (pb) Tm * (oC) Hu (2004) IBSSR 10 (AG)8A2 (AG)7 217 60 IBSSR 19 (CA)25 181 65 Huamani (2009) IbN34 (CT)8 308 55 IbN18 (CT)11 195 59 IbN37 (TA)7T 184 IBSSR25 (GT)15T2(TG)9 130 Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

15 METODOLOGIA M13-Tailing
Secuencia de nucleótidos (5´-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3`) Extremo 5’ del primer Fw SSRs PCR: Cola de nucleótidos + M13 Primer ( nm) Productos amplificados SSR marcados Fotodiodos LICOR detectan la IR 11 loci SSRs Imágenes del gel S. SAGA Genotipaje Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

16 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ANÁLISIS 8 LOCI SSRS Diversidad genética
Estructura genética Análisis de duplicados PROGRAMAS ESTADISTICOS 8 LOCI SSRS Matriz Genotípica de datos Modalidades de análisis Cultivadas vs silvestres Cultivadas vs cultivadas Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

17 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

18 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN
Altas concentraciones de ADN (rendimiento 8 ug). Optimización de tiempo y costos en el laboratorio. Cuantificación de ADN en gel de agarosa al 1% utilizando muestra fresca Menores concentraciones de ADN (rendimiento 5.5 ug). Mejor calidad de ADN (menor incidencia de impurezas). Cuantificación de ADN en gel de agarosa al 1% utilizando muestra seca Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

19 GENOTIPAJE DEL CAMOTE Y ESPECIES SILVESTRES
En la mayoría de genotipos existió una pérdida de genotipos por patrones de herencia tetrasómica del camote (Buteler, 1999). Resultados demuestran que existe un bajo porcentaje de SSRs capaces de amplificar en especies hexaploides (Buteler, 1999; Hu, 2004). Alelos de camote obtenidos con el locus IbE14 en el LI-COR Alelos de silvestres obtenidos con el locus IbE14 en el LI-COR Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

20 DIVERSIDAD GENÉTICA DE CAMOTE
Número de alelos Locus No alelos HE HO PIC IbE 05 7 0,6485 0,6207 0,6138 IBSSR 10 6 0,7853 0,6154 0,7584 IBSSR 27 0,6870 0,3158 0,6302 IBSSR 04 0,5995 0,3729 0,5372 IbN 18 8 0,7494 0,4310 0,7114 IbN 34 3 0,4999 0,0339 0,4044 IbE 14 17 0,9130 0,6102 0,9063 IbE 27 0,6823 0,1356 0,6246 Promedio 7,5 0,6956 0,3919 0,6483 Valor más cercano a otros estudios (Veasey et al., 2008; Roullier et al., 2011) Valor mas lejano: (Karuri et al., 2010; Yánez, 2002; Hu et al., 2004; Buteler et al., 1999). HE: Ecuador : Centro secundario de diversidad genética. HO: Reproducción alógama del camote. PIC: IbE 14: Marcador mas informativo Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote. Gabriela Basantes, 2012.

21 DIVERSIDAD GENÉTICA DE ESPECIES SILVESTRES
Locus No Alelos Ho PIC IbE 05 5 0,2143 0,6457 IBSSR 10 4 0,1250 0,6357 IBSSR 27 1 0,0000 IBSSR 04 IbN 18 2 0,1333 0,1167 IbN 34 7 0,7935 IbE 14 8 0,2667 0,7493 IbE 27 0,0714 0,5101 Promedio 0,1013 0,4314 Alto numero de alelos y PIC: Aptos para estudios de diversidad genética Bajo numero de alelos y PIC: Utilizar SSRs en estudios de especies de las cuales fueron originalmente aislados (Buteler et al, 1999). Ho: Mayor parte de materiales son de naturaleza autógama Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote. Gabriela Basantes, 2012.

22 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
ESTRUCTURA GENÉTICA UPGMA No existió formación de grupos específicos de acuerdo a las zonas geográficas de origen. La pérdida de correlación geográfica entre genotipos de camote ha sido también reportado por otros autores (Karuri et al., 2010; Veasey et al., 2008). Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

23 ESTRUCTURA GENÉTICA ANÁLISIS DE COORDENADAS PRINCIPALES EN 2D
Grupo cultivado “G1” mayor variabilidad genética Grupo cultivado “G2” base genética menor al grupo “G1”. Compartimiento de bandas (Jarvis & Hodgkin, 1999). Ratificación de resultados mediante asignación genética. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

24 ESTRUCTURA GENÉTICA Asignación Genética Asignación Genética Cuando K=3
Flujo genético Asignación Genética Cuando K=3 Asignación genética de poblaciones Status “G2” “G1” “S” Híbridos Total Cultivado “G2” 44 Cultivado “G1” 15 Silvestre “S” 24 6 30 89 Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

25 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
FLUJO GENÉTICO ENTRE “G1” Y “S” Lugares en donde existe una mayor concurrencia de cultivos domesticados con sus parientes silvestres (Lapeña, 2005). Factores que aseguran la hibridación (Papa et al,2005): Factores humanos-ambientales Factores biológicos Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

26 ESTRUCTURA GENÉTICA AMOVA Mutaciones
Origen de la variación genética gl Suma de cuadrados Componentes de la varianza % de la variación genética Entre poblaciones 2 118,679 1,967 26% * Dentro de cada población 86 484,010 5,628 74% * Mutaciones Sistema de reproducción del camote Intercambio de materiales entre agricultores Influencia de los agricultores por mantener sus variedades dentro de las regiones. Otros estudios también han mostrado una alta diversidad dentro de las poblaciones (Zhang et al., 2000, 2004), Veasey et al., (2008), Roullier et al., (2011)) Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

27 Distancia genética (D)
ESTRUCTURA GENÉTICA DISTANCIA GENÉTICA DE NEI Status 1 Status 2 Distancia genética (D) G1 S 0.042 G2 0.20 0.081 “G1” y “S” (Flujo genético): misma sincronización en los tiempos de florecimiento y compatibilidad sexual y simpatría existente entre estos dos grupos (Jarvis & Hodgkin, 1999). “G2” - “S” (Ausencia de flujo genético): Diferencias en la época de cruzamiento a pesar de estar en la misma zona. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote. Gabriela Basantes, 2012.

28 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
DIVERSIDAD GENÉTICA Alelos compartidos entre camote y especies silvestres Poblaciones Numero de alelos compartidos G1- G2- S 3 G2 –S 12 G1-S 8 alelos Alelos privados entre camote y especies silvestres Status de la Población Cultivado 1 (G1) Cultivado 2 (G2) Silvestre (S) Número total de Alelos en la Población Freq. >= 5% 31 49 48 No alelos privados 2 8 14 Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

29 IDENTIDAD GENETICA EN MATERIALES CULTIVADOS DE CAMOTE
Materiales cultivados con un 99% de similitud genética MTCG 007 Guayaco (código 39) = MTCG 008 Guayaco (código 40) ECU (código 54 ) = ECU (código 55) Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

30 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
ESTRUCTURA GENÉTICA ANALISIS CON 11 LOCI SSRs Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

31 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

32 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONCLUSIONES Con el protocolo utilizado para muestras frescas, se obtuvo altas concentraciones de ADN mientras que con la metodología empleada para muestras secas se obtuvo menores concentraciones. Este ultimo no afectó a nuestro estudio, ya que los marcadores SSRs no requieren de altas concentraciones de ADN. Se aportó al conocimiento de los beneficios de otra técnica basada en muestra seca que pueda ser utilizada en muestreos in situ. La caracterización de materiales de camote con ocho loci SSRs, determinó niveles elevados de riqueza alélica (7.5 alelos /locus) y de PIC (0.648), demostrando una alta variabilidad genética y PIC en los materiales analizados. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

33 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONCLUSIONES El análisis de especies silvestres con 8 loci SSRs detectó una baja riqueza alélica (4 alelos /locus) y PIC (0.4314), debido a que estos loci no fueron originalmente aislados del genoma de especies silvestres. El locus IbE14 en camote (17 alelos) y los loci IbE14 e IbN34 (8 alelos y 7 alelos respectivamente) en el caso de materiales silvestres proporcionaron el mayor número de alelos. El valor de Ho para materiales cultivados fue de , reflejando su naturaleza alógama. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

34 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONCLUSIONES Los análisis estadísticos permitieron distinguir 3 grupos genéticos, 2 grupos cultivados de camote (“G1” y “G2”) y 1 grupo silvestre (“S”). Se confirmó la existencia de flujo genético entre la población “G1” y silvestre “S”, posiblemente al intercambio genético producido en los lotes de siembra de estos cultivos. Los grupos “G1” y “G2” se diferencia por el tipo de zona geografica a la que pertenecen sus materiales. Se encontraron 2 parejas de materiales con identidad genética. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

35 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN 2. OBJETIVOS 3. MATERIALES Y MÉTODOS 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES Fuente: Google Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

36 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
RECOMENDACIONES El presente estudio constituye el primer reporte de caracterización molecular del germoplasma de camote y especies silvestres en el INIAP, contribuyéndose al conocimiento de una parte de la diversidad genética de estas especies en un centro de origen y diversificación, como es el Ecuador. Al final de este estudio se espera el establecimiento de un set representativo de materiales silvestres para trabajos de uso y mejoramiento de germoplasma de camote beneficiando al sector productivo agrícola.  Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.

37 Gabriela Basantes. 2012. Caracterización molecular de camote.
AGRADECIMIENTOS Proyecto “Innovaciones para emprendimiento de yuca y camote en la seguridad, soberanía alimentaria y oportunidades de mercado en el Ecuador”(SENESCYT Código 2407). Departamento Nacional de Biotecnología . Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos (DENAREF). ESPE- Departamento de Ciencias de la Vida-Ingeniería en Biotecnología. Gabriela Basantes Caracterización molecular de camote.