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Introducción a las enzimas. What is a catalyst? Example: A catalyst is a compound which enhances the rate of a chemical reaction without being destroyed.

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Presentación del tema: "Introducción a las enzimas. What is a catalyst? Example: A catalyst is a compound which enhances the rate of a chemical reaction without being destroyed."— Transcripción de la presentación:

1 Introducción a las enzimas

2 What is a catalyst? Example: A catalyst is a compound which enhances the rate of a chemical reaction without being destroyed or incorporated in the product(IUPAC)

3 ENZIMAS

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12 Features of a catalyst: Makes an alternative reaction path in which less activation energy is needed. Equally increases the rate of the back and forth reaction reaction catalysis has no effect on equilibrium position!

13 Reaction equations and reaction rate A reaction like A B may run via route 1; the rate is determined by the magnitude of E a (1) Alternatively, the reaction runs via an intermediate, like 2. The rate is determined by the slowest step (= the one with the highest E a ). Alternatively, the reaction can run via more intermediates, like 3 A B 1 E 2 3 Ea(1)Ea(1)

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15 What kinds of catalysts are there around? Organic Inorganic Biological (biocatalyst) Other way of subdivision: Homogeneous = freely dissolved in solution –organic catalyst –organometallic complex –enzyme in water Heterogeneous = solid, in liquid or gaseous environment –inorganic catalyst (e.g. zeolite) –immobilised enzyme –enzyme in an organic solvent

16 Determination of reaction rates Determination of the concentration of a compound (substrate, product), as a function of time. The method used depends on the properties of the compound. Chromatography –Example:

17 GC analysis of the esterification of racemic menthol with vinyl acetate, catalysed by Candida rugosa lipase, in diisopropyl ether as the solvent. I.S., internal standard (decane). An enantioselective GC column is used, so the enantiomers are separated. There is only one product peak because the reaction is stereoselective.

18 Another example: the chlorination of barbituric acid (1) by chloroperoxidase from Caldariomyces fumago

19 UV spectroscopy Example: chlorination of 1 by chloroperoxidase Can be done quantitatively through Lambert-Beers law: A =.c.d

20 IR spectroscopy Example: oxime formation Problem: not quantitative Polarimetry (only for chiral compounds) Example: hydrolysis of sucrose: C 12 H 22 O 11 + H 2 O C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6 sucrose + water glucose + fructose [ ] D 20 = +66,5° [ ] D 20 = +52° [ ] D 20 = –92° (together [ ] D 20 = –40°) Can be done quantitatively

21 Invertase (IT) IT Sucrose Non-reducing sugar Reducing sugars Glucose Fructose Reducing Power + HOCH 2 O OH HOCH 2 O OH O HOCH 2 OH H2OH2O O HOCH 2 HO O HOCH 2 O O b b CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH H 2 C-OH C=O HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH Juang RH (2004) BCbasics 12

22 NMR spectrometry deuterated solvents are necessary can be done quantitatively Titration Example: ester hydrolysis Ester + water acid + alcohol Excellent for quantitative measurements; hooked up to computer. ml base added vs time; slope = reaction rate

23 Catálisis: Leyes Generales de la Catálisis Catalizadores biológicos Velocidades más elevadas de reacción Condiciones de reacción mas suaves Mayor especificidad de reacción Capacidad para la regulación

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25 Tipos de reacciones Acido-base Oxidación-reducción Radicales libres: adición y abstracción Condensación Adición a dobles enlaces Sustitución nucleofílica

26 Reacciones de oxidación y reducción

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28 Coenzymes and Prosthetic Groups some enzymes employ coenzymes and prosthetic groups at their active sites –used for reactions that amino acid R groups cant perform coenzymes –metals or small organic molecules –not covalently bound to protein –often function as co-substrates –precursors are often vitamins prosthetic groups –small organic molecules –covalently linked to protein Enzymes and Enzyme Kinetics

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30 Rompimiento homolítico de enlaces

31 Rompimiento heterolítico de enlaces

32 Condensación: formación de un enlace covalente concomitante con la pérdida de una molécula de agua Ester: ácido carboxílico + alcohol Eter: dos alcoholes (autocondensación) Amida: amina (1a o 2a) + alcohol Reacciones de condensación

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34 La reacción opuesta a la condensación: la hidrólisis

35 Sustitución nucleofílica

36 Reacción de 1er orden: La velocidad solamente depende de la concentración del sustrato orgánico y no de Z

37 Reacción de 2o orden: La velocidad depende tanto de la concentración del sustrato orgánico como de Z

38 1.-El sustrato -Los compuestos con impedimento estérico siguen el mecanismo SN1 -Los carbonos terciarios, alílicos o bencílicos siguen un mecanismo SN1 ya que pueden formar carbocationes estables R R-C-L CH 2 =CHCH 2 L C 6 H 5 CH 2 L R -Los carbonos simples siguen un mecanismo SN2 CH 3 -L R-CH 2 -L R-CH-L R Factores que influyen en la reacción de sustitución

39 2.- El nucléofilo -Mientras más fuerte sea el nucleófilo, mayor será la velocidad de la reacción SN2 Un nucleófilo con carga negativa es más fuerte que su ácido conjugado HO - > H 2 O RO - > ROH RS - > RSH La fuerza del nucleófilo es paralela a la basicidad, en un grupo de nucleófilos donde el átomo nucleofílico es el mismo RO - > HO - > ArO - > RCOO - > ROH > H 2 O Cuando se examina la fuerza relativa de los compuestos que pertenecen al mismo grupo de la tabla periódica, se encuentra que el que tiene el átomo nucleofílico más grande es un nucleófilo más fuerte RSH > ROH RS - > RO - I - > Br - > Cl - > F - -El impedimento estérico que tenga el nucléofilo, importante para la reacción SN2 Factores que influyen en la reacción de sustitución

40 3.- El grupo saliente -Los mejores grupos salientes (L) son aquellos que forman la molécula o ion más estable una vez que se separa. Mientras menos básico sea el grupo más fácilmente se separa. Por ejemplo, el agua es mejor grupo saliente que el ion hidróxido; los alcoholes son mejores grupos salientes que los alcóxidos; los iones haluro, sulfonato, sulfato y carboxilato son buenos grupos salientes. R-OH + X - = R-X + HO - R-OH X - = R-X + H 2 O X-: ion haluro En general, son buenos grupos salientes los que tienen átomos electronegativos y que pueden estabilizar electrones a su alrededor Factores que influyen en la reacción de sustitución

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42 Example: hydrolysis of alkyl bromides R-Br + OH – R-OH + Br – (S N 2 reaction) Reaction takes place by collision of the particles RBr and OH –, implying that the reaction rate is directly proportional to [RBr] and [OH – ]. Alternative: These are the most common reaction situations: - bimolecular:2 particles collide and react - monomolecular:1 particle dissociates or reacts E.g., the reaction below runs through a large number of bi- and monomolecular steps: MnO 4 – + 5 Fe H + Mn Fe H 2 O

43 Nu: + R-L = Nu-R + :L Reacciones de sustitución nucleofílica NucleófiloSustrato Gpo. Saliente ProductoSíntesis de HO - R-L(-L) R-OHAlcoholes H 2 OR-L(-HL) R-OHAlcoholes RO - R-L(-L) R-O-REteres R-OHR-L(-HL) R-O-REteres HS - R-L(-L) R-SHTioles NH 3 R-L(-HL) R-NH 2 Amina 1a RNH 2 R-L(-HL) R-NH-RAmina 2a R 2 NHR-L(-HL) R 3 NAmina 3a N 3 - R-L(-L) R-N 3 Azida de alquilo I - R-L(-L) R-IYoduro de alquilo RCOO - R-L(-L) RCOOREster RCOOHR-L(-HL) RCOOREster CN - R-L(-L) R-CNNitrilo

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45 Turn Over Numbers of Enzymes Catalase H 2 O 2 Carbonic anhydrase HCO 3 - Acetylcholinesterase Acetylcholine 40,000, , ,000 b-Lactamase Benzylpenicillin 2,000 Fumarase Fumarate 800 RecA protein (ATPase) ATP 0.4 EnzymesSubstrate k cat (s -1 ) The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

46 K m : Hexokinase Example Glucose + ATP Glc-6-P + ADP GlucoseAlloseMannose Substrate number K m = 8 8,000 5 mM CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H 2 -C-OH Juang RH (2004) BCbasics

47 Chymotrypsin Has Distinct k cat / K m to Different Substrates O R O H 3 C–C–N–C–C–O–CH 3 H H = – = –– –HGlycine k cat / K m –CH 2 –CH 2 –CH 3 Norvaline –CH 2 –CH 2 –CH 2 –CH 3 Norleucine –CH 2 – Phenylalanine (M -1 s -1 ) R = Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

48 Lipases catalyse the hydrolysis of triglycerides: The active site of lipases contain 3 essential amino acids: asp, his and ser. Lipases have ~250 other amino acid residues. Why? Tripeptide asp-his-ser enhances the hydrolysis rate of triglycerides by a factor 2-10; lipases by a factor How do they do that?

49 Why are lipases such active enzymes? Exact alignment of the asp, his and ser side chains Stabilisation of the intermediate C-O Ensure the correct asp, his and ser Stabilise against proteolysis and denaturation

50 Charge Relay in Active Site Ser 195 His 57 Asp 102 H–O–CH 2 O C–O - = Active Ser H–N N CC C H H CH 2 Ser 195 His 57 Asp O–CH 2 O C–O–H = N N–H CC C H H CH 2 Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

51 Imidazole on Histidine Is Affected by pH H–N N C C C H H H+H+ pH 6pH 7 + H–N N–H C C C H H Inactive + Ser 195 His 57 Asp 102 H–O–CH 2 O C–O - = H–N N–H CC-H C CH 2 H Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158 Adapted from Dressler & Potter (2000) Discovering Enzymes, p.163

52 pH Influences Chymotrypsin Activity pH Relative Activity Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.162

53 pH Influences Net Charge of Protein Juang RH (2004) BCbasics + Net Charge of a Protein Buffer pH Isoelectric point, pI

54 Ejemplo de Catálisis, una Serina proteasa

55 - Plegamiento: Proporciona un andamio que permite a los aminoácidos catalíticos estar en la posición espacial adecuada para llevar acabo su función, además, genera un medio ambiente adecuado para la captura de los sustratos.

56 La triada catalítica SER-HIS-ASP Serin-proteasa de Bacillus lentus

57 O (CH 3 ) 2 CH–O– P –O–CH(CH 3 ) 2 F = Chymotrypsin Ser195 Inhibited by DIFP Diisopropyl-fluorophosphate (DIFP) Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.167 O - …H CH 2 Ser 195 O (CH 3 ) 2 CH–O– P –O–CH(CH 3 ) 2 = O CH 2 Ser 195 XX

58 Chymotrypsin Also Catalyzes Acetate O -C N- H O -C O- Peptide bond Ester bond O CH 3 –C–O– –NO 2 Nitrophenol acetate HO– –NO 2 O CH 3 –C–OH Hartley & Kilby Chymotrypsin+ H 2 O Nitrophenol Acetate No acetate was detected at early stage Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.168

59 O -CO -C Time (sec) Nitrophenol Two-Stage Catalysis of Chymotrypsin O CH 3 –C–O– –NO 2 Nitrophenol acetate OCOC O CH 3 –C HO– –NO 2 + H 2 O O-H C CH 3 COOH Kinetics of reaction Two-phase reaction Acylation Deacylation (slow step) Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.169

60 Specificity of Ser-Protease Family COO - C Asp COO - C Asp Active Site TrypsinChymotrypsinElastase cut at Lys, Argcut at Trp, Phe, Tyrcut at Ala, Gly Non-polar pocket Deep and negatively charged pocket Shallow and non-polar pocket O O –C–N–C–C–N– C NH 3 + O O –C–N–C–C–N– C O O –C–N–C–C–N– CH 3 Juang RH (2004) BCbasics

61 Modification of Subtilisin and Its Activity Change No enzyme 1 Asn 155 Leu 10,000,000 ( Asn 155 stabilizes transition state ) His & Asp Ala 37,000 Ser, His & Asp Ala 4,000 Subtilisin 10,000,000,000 Active Site Relative Modification Triad: SerHisAsp activity Ser Ala 5,000 Asp Ala 330,000 Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.245

62 Chymotrypsin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Leu – Trypsin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Val – Elastase – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Leu – Thrombin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Phe – Plasmin – Gly – Asp – Ser – Gly – Gly – Pro – Leu – Acetylcholinesterase – Gly – Glu – Ser – Ala – Gly – Gly – Ala – Chymotrypsin – Val – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Gly – Trypsin – Val – Ser – Ala – Gly – His – Cys – Tyr – Elastase – Leu – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Ile – Thrombin – Leu – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Leu – Plasmin – Leu – Thr – Ala – Ala – His – Cys – Leu – Acetylcholinesterase – – – – – – – – – – – – – His – – – – – – – – Ser 195 Chymotrypsin – Thr – Ile – Asn – Asn – Asp – Ile – Thr – Trypsin – Tyr – Leu – Asn – Asn – Asp – Ile – Met – Elastase – Ser – Lys – Gly – Asn – Asp – Ile – Ala – Thrombin – Asn – Leu – Asp – Arg – Asp – Ile – Ala – Plasmin – Phe – Thr – Arg – Lys – Asp – Ile – Ala – Acetylcholinesterase – – – – – – – – – – – – – – Asp – – – – – – – His 57 Asp 102 Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.244 Serine Protease and AchE

63 H AchE AchE Has Similar Catalytic Mechanism O -CO -C H O CH 3 CH 3 –C–O–CH 2 –CH 2 –N–CH 3 CH 3 + H-O-HH-O-H AchE OCOC H O CH 3 –C CH 3 HO–CH 2 –CH 2 –N–CH 3 CH 3 + H2OH2O AchE O -CO -C H H O CH 3 –C–OH Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.243 AchE O -CO -C H O CH 3 –C CH 3 O–CH 2 –CH 2 –N–CH 3 H CH 3 + Deacylation Acylation

64 La posición espacial relativa de los elementos catalíticos se mantiene aunque la secuencia de aminoácidos cambie.

65 Cholinesterase Dienelactone hidrolase Lipase/Cutinase Thioestearase Serine Carboxypeptidase Prolyl Imino/Oligo peptidase Bromoperoxidase Haloalkane dehalogenase Fluoroacetate dehalogenase Epoxide hydrolase Hydroxynitrile lyase C-C Hydrolase 2,4-Dioxygenase TIM barrels

66 grupo guanidino de Arg grupos carboxilo de Glu y Asp grupo sulfhidrilo de Cys grupo imidazol de His grupo amino de Lys grupo tioéter de Met grupo indoílo de Trp grupo hidroxilo fenólico de Tyr pKa

67 Características funcionales de barriles TIM Sitio activo en la terminal carboxilo de las hebras Hélices orientadas paralelamente forman un dipolo Sitio activo: Atractor natural de cargas negativas Sustratos naturales fosforilados en la mayoría de los casos

68 - Flexibilidad: La tapa del sitio activo de algunas enzimas presenta mobilidad. - Sitios Alostéricos: Activan a la proteína desde regiones alejados del sitio activo. - Cambios conformacionales: Suceden al unir un sustrato. Glucocinasa Glucosamina 6-Fosfato-desaminasa

69 - Aminoácidos catalíticos: Son los involucrados en la función. - Están directamente involucrados en la catálisis. - Ejercen un efecto en otro residuo o molécula de agua que está directamente relacionado con la catálisis. - Estabilizan el estado de transición. - Ejercen algún efecto en el sustrato o cofactor que ayuda a la catálisis. - Aminoácidos del sitio activo no catalíticos: Participan en el reconocimiento del sustrato y lo colocan en la orientación correcta.

70 Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que estabilizan al Pirofosfato. Aminoácidos del sitio activo no catalíticos que estabilizan a los sustratos. Aminoácidos catalíticos Arg59, Ser130, Lys 159 Mg ++ Sitio Activo de la Tiamina Fosfato Sintasa

71 Analysis of Catalytic Residues in Enzyme Active Sites JMB (2002) 324,

72 His, Asp y Glu casi siempre son catalíticos

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75 Conclusiones: - Los aminoácidos mayoritariamente catalíticos son histidina, cisteina, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina. - Están muy poco expuestos al solvente, a pesar de su polaridad. - Casi todos están formando puentes de hidrógeno. - Tienen una movilidad muy baja en comparación con los demás aminoácidos. - La función de un aminoácido catalítico es estabilizar un intermediario del estado de transición, actuar como nucleófilo o ser donador o aceptor de protones.


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