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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LAS RAZAS DE CANGUIL, TUSILLA Y MEZCLAS DE MAÍZ DEL BANCO DE TRABAJO DEL PROGRAMA DE MAÍZ DEL INIAP Elaborado por María Cristina.

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1 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LAS RAZAS DE CANGUIL, TUSILLA Y MEZCLAS DE MAÍZ DEL BANCO DE TRABAJO DEL PROGRAMA DE MAÍZ DEL INIAP Elaborado por María Cristina Silva Cisneros Directora PhD. Karina Proaño Codirector Ing. Marco Taipe

2 Maíz (Zea mays L.) Componentes básico en la dieta de la población. Gran cantidad de terreno destinado a su producción. Fuente importante de diversidad genética. Ecuador 29 razas. Sierra (17 razas) y región litoral y la amazonia (12) En las últimas décadas se ha presentado erosión genética Maíces criollos se debe al incremento de cultivos con variedades comerciales de mayor rendimiento, la introducción de modelos de producción de agricultura moderna, expansión de la frontera agrícola y la modificación en los sistemas de producción.

3 Reventón (2260 msnm). Plantas pequeñas con hojas angostas. Mazorca es de color amarillo, blanco, rojo. Granos puntiagudos. Tusilla Mezclas Canguil ( 90 a 1500 msnm). Plantas desarrolladas. Hojas largas, delgadas y rígidas. Mazorcas medianas, flexibles, delgadas y cilíndricas. Granos redondos duros de color amarillo. Germoplasma conservado en el Banco de Trabajo del Programa de Maíz

4 Zhubay (2), Morocho (4), Zhima (7), Cuzco (3), Maiz rojo (1), Maiz negro (1), Negro pajizo (1), Morocho Mizhado (1), Rojo Negro (1), Abuelito (1), Moteado (1), Banco BCOM (1), BCOPunton (1), Rojo Pajiro (1), Blanco M (1), Amarillo (1), Cola de zorro (1). Maíz Criollo (1) Sal Prieta (2) Diente de león (1) Maicena (5) morochillo (1) Maiz suave común (1) Maiz Chazo (1), Maiz Chillo (1), variedades INIAP (7), Pob. Chulpi (1), Pob. Rac de uva (1), Pob. Uña de gato (1), Pob. Blanco precoz (1) Mezclas

5 PM: Evaluación y caracterización morfológica molecular por microsatélites de maíz (Zea mays) de altura (Morales, 2003). DNB: Caracterización molecular de la colección núcleo de maíz (Zea mays) de altura del banco de germoplasma del INIAP mediante marcadores moleculares microsatélites (Garrido, 2010). Avances registrados

6 Caracterización del germoplasma Diferencias y similitudes entre las variedades criollas de maíz a nivel de secuencias de ADN Erosión genética- perdida recursos Caracterización molecular Canguil->rescatar, conservar y usar el germoplasma Tusilla-> información genética base en programas de fitomejoramiento Canguil->rescatar, conservar y usar el germoplasma Tusilla-> información genética base en programas de fitomejoramiento

7 GENERAL Caracterizar molecularmente las razas de canguil, tusilla y mezclas de maíz del Banco de Trabajo del Programa de Maíz del INIAP. ESPECÍFICOS Determinar la variabilidad genética de las razas de canguil, tusilla y mezclas de maíz a través de 9 marcadores moleculares microsatélites. Analizar la diversidad genética existente del germoplasma en estudio, mediante herramientas bioinformáticas que determinen accesiones potenciales para futuros programas de fitomejoramiento.

8 Las variedades de canguil y tusilla no se diferencian del resto de materiales a nivel genético, utilizando nueve marcadores moleculares microsatélites.

9

10 Germinación de semillas 86 accesiones BT del PM (3 replicas por cada accesión) Extracción 15 d. ADN del primordio foliar. Ferreira y Grattapaglia (1998) Cuantificación Espectrofotómetro para microplacas Epoch TM de BioTek Concentración de 256 muestras

11 Validación 256 muestras con primer phi116 y phi121 (DNB) Selección de primers (M13-Tailing SSR) Probaron 13 primers (Garrido, 2010) PowerMarKer (PIC) Amplificación de las variedades (M13- Tailing SSR) Combinaciones duplex y triplex en LICOR4300. Incorporar la secuencia del primer M13 (5´-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3´) al extremo inicial 5´ del primer forward microsatélite Productos de amplificación detectados por los lectores láser del secuenciador automático de ADN Analyser LICOR-4300. La imagen se visualiza en el software SAGA-GT, asistente de lectura (LICOR-4300).

12 Genotipaje software SAGA-GT Misrosatellite Determinar el peso de los alelos (pb) 251 pb 242 pb

13 Matriz genotípica (pb) GenAlex6.5, PowerMaker, NTSYS-pc, Infogen.

14

15 Germinación 256 semillas (accesión 45 Tusilla sin replicas) Extracción, cuantificación y validación 631,378 ng/µl Selección de primers SSR 13 probados, se selecciono 9 polimórficos

16 PIC de los primers phi: 072, 031, 083, 033, 015, 059, 034, 053, 050; fueron altos. CombinaciónPrimers SSR Marcaje Tamaño esperado (pb)* Temperatura annealing (°C) A phi083 phi033 800nm 144-156 259-287 56 B phi015 phi059 800nm 102-126 166-181 56 C phi034 phi053 phi050 800nm 122-146 188-214 80-86 56 D phi072 phi031 700nm 162-186 206-244 56

17 Análisis global de diversidad genética Frecuencia de alélica Número de genotipos Número de alelos Heterocigosis esperada Heterocigosis observada Índice de información polimórfica Estructura genética Análisis de agrupamiento Análisis multivariado Análisis estadístico de diversidad genética por razas y mezclas de maíz Canguil y Tusilla Mezclas de Maíz Bootstrap Poblaciones: Canguil, Tusilla y Mezclas de maíz

18 LI-COR 4300 Saga GT Microsatellite Microsoft Excel Locus Mayor frecuencia alélica Número de genotipos Número de alelos Heterocigosis esperada Heterocigosis observada PIC phi072 0.5412 16 9 0.6151 0.5844 0.5589 phi031 0.5485 17 8 0.6341 0.5242 0.5927 phi083 0.5069 12 6 0.6358 0.3333 0.5770 phi033 0.6168 26 11 0.5829 0.4754 0.5544 phi015 0.3441 22 8 0.7333 0.5628 0.6903 phi059 0.3024 22 8 0.7771 0.4758 0.7421 phi034 0.4758 20 9 0.6902 0.4597 0.6489 phi050 0.8532 5 3 0.2608 0.0894 0.2443 phi053 0.3791 27 10 0.7183 0.6230 0.6732 Promedio 0.5076 18.5556 8 0.6275 0.4587 0.5869

19 Alelos compartidos (Shared Allele Distance, DAS)

20 Análisis de coordenadas principales (PCO) de 256 muestras de maíz analizados con 9 primers SSRs. Elaborado por: Silva, 2014. IValor EigenPorcentajeAcumulado 15.0693977910.5182 22.833986105.880116.3983 32.516051945.220421.6187 Canguil blanco proveniente de Cotopaxi Mezclas de maíz (accesiones austro: Cuzco, Zhima)

21 Fuente de variación Grados de libertad Suma de cuadrados Cuadrados medios Variación estándar Porcentaje Entre razas 33174.8875.3000.2167% Entre Individuos68272.3334.0051.02032% Dentro de cada Individuo 102200.5001.966 61% Total203647.7213.201100% Porcentajes obtenidos en el AMOVA de las razas canguil y tusilla de 100 muestras con 9 primers SSRs. Elaborado por: Silva, 2014. Los niveles de variación indican una mayor diferenciación genética dentro de cada individuo

22 Correlación entre genes homólogos tomados de un nivel de subdivisión (endogamia) y por tanto, es posible medir este efecto en términos de la reducción en la proporción de genotipos heterocigótico (Eguiarte et al., 2010). Elaborado por: Silva, 2014 LocusFisFitFstNm phi072-0.2350.1450.3080.563 phi031-0.2800.0640.2690.679 phi0830.0910.5280.4800.270 phi0330.0970.2910.2150.915 phi015-0.0280.1890.2110.934 phi0590.1070.3610.2840.629 phi0340.0270.2740.2540.735 phi0500.3960.5930.3270.515 phi053-0.1310.1670.2630.699 Promedio0.0050.290 0.660 Fis ~ 0 frecuencias genotípicas estrictamente al azar. Fst ~ 0 frecuencias alélicas iguales. Aún no exite diferenciación. Nm ~ 1 deriva génica actúa independiente cada población.

23 Poca diferenciación entre accesiones, con valores cercanos a 1, debido al parentesco genético. Tusilla (21 accesiones) Canguil (13 accesiones) Diferenciación entre razas, debido a que los valores de distancia fueron cercanos a 0. La mayor similitud: tusilla de Manabí con tusilla de Napo (0.998) La mayor diferencia: tusilla de Orellana con tusilla de Sucumbíos (0.099)

24 Fuente de variación Grados de libertad Suma de cuadrados Cuadrados medios Variación estándar Porcentaje Entre variedades 51218.6894.2880.1084% Entre Individuos104378.5003.6390.87130% Dentro de cada Individuo 156296.0001.897 66% Total311893.1892.877100% Porcentajes obtenidos en el AMOVA de las mezclas de maíz de 123 muestras con 9 primers SSRs. Elaborado por: Silva, 2014. Los niveles de variación indican una mayor diferenciación genética dentro de cada individuo.

25 Elaborado por: Silva, 2014 LocusFisFitFstNm phi072-0.305-0.0150.2220.874 phi031-0.1870.2610.3780.412 phi0830.0590.3950.3560.452 phi033-0.2280.0850.2550.729 phi0150.0540.2380.1941.040 phi0590.2470.3870.1861.096 phi0340.1810.3330.1861.097 phi0500.4750.7730.5680.190 phi053-0.1370.1080.2150.911 Promedio0.0180.2850.2840.756 Fis ~ 0 frecuencias genotípicas estrictamente al azar. Fst ~ 0 frecuencias alélicas iguales. Aún no exite diferenciación. Nm ~ 1 deriva génica actúa independiente cada población.

26 Si las frecuencias alélicas son idénticas entonces I=1 (identidad máxima posible) Mientras si no comparten ningún alelo I=0 (identidad mínima posible) La mayor similitud: Sal prieta y Rojo Pajiro (0.977) La mayor diferencia: Rojo Pajiro y Abuelito (0.043) Mezclas de maíz (52 accesiones)

27 LocusEstadísticoPob1 Pob2Pob3 phi072 phi031 phi083 phi033 phi015 phi059 phi034 phi050 phi053 Diversidad genética 0.727 0.649 0.724 0.670 0.707 0.726 0.750 0.560 0.767 0.667 0.740 0.710 0.668 0.610 0.748 0.732 0.363 0.732 0.607 0.649 0.667 0.571 0.774 0.796 0.634 0.309 0.371 Medida de variabilidad a partir de la muestra original sin Bootstrap para 3 poblaciones con 9 primers SSR Pob2: Tusilla Pob3: Mezclas maíz Pob1: Canguil

28 LocusPob1Pob2Pob3 phi072 phi031 phi083 phi033 phi015 phi059 phi034 phi050 phi053 0.713 0.646 0.708 0.660 0.697 0.714 0.738 0.549 0.756 0.659 0.730 0.699 0.659 0.603 0.741 0.725 0.349 0.723 0.605 0.646 0.665 0.570 0.772 0.793 0.633 0.308 0.715 Estimaciones por Bootstrap LocusPob1Pob2Pob3 phi072 phi031 phi083 phi033 phi015 phi059 phi034 phi050 phi053 0.029 0.035 0.033 0.049 0.029 0.032 0.024 0.065 0.034 0.033 0.021 0.022 0.042 0.030 0.025 0.021 0.067 0.029 0.024 0.029 0.026 0.035 0.011 0.012 0.027 0.046 0.017 Errores estándares por Bootstrap Mezclas de maíz bootstrap: 79.3%, -> es: 1.2% primer phi059 polimórfico (PIC=0.74) Canguil bootstrap: 75.6% -> es: 3.4% Tusilla bootstrap: 74.1% -> es: 2.5%

29 Existe una alta diversidad genética (0.63) En el análisis de diversidad genética por razas de canguil y tusilla, el AMOVA dio un 7% de variabilidad genética. En los estadísticos F se observó un valor de diferenciación genética de 0.5% entre las razas. La mayor similitud en la distancia genética fue observada en las variedades tusilla de Manabí con tusilla de Napo. En el análisis de diversidad genética para las mezclas de maíz el AMOVA dio un 4% de variabilidad genética. En los estadísticos F se observó un valor de diferenciación genética de 1.8% entre las variedades. La mayor similitud en la distancia genética fue para las variedades Sal prieta y Rojo Pajiro. Con el análisis Bootstrap se obtuvo que el locus phi053 es el más polimórfico en las poblaciones. La colección del Banco de Trabajo del Programa de Maíz posee diversidad genética, la mayor parte ocurre dentro de las poblaciones más que entre las razas.

30 Se recomienda el uso un mayor número de marcadores moleculares SSRs para posteriores estudios de variabilidad genética en maíz. Debido a la información existente sobre el genoma del maíz se podrían escoger primers que se encuentren ligados a genes de interés para obtener variedades mejoradas con características agronómicas deseadas. Se debería realizar un análisis georeferenciado para identificar si existe relación del flujo génico de acuerdo a la ubicación geográfica de los materiales de maíz colectados. Para estudios de estructura genética más precisos de Zea mays se recomienda usar técnicas moleculares con el ADN cloroplastidico para determinar el origen y la relación entre variedades.

31 Instituto Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) Programa de Maíz-Departamento Nacional de Biotecnología. Ing. Msc. Carlos Yánez y Dr. Eduardo Morillo Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE Directora PhD. Karina Proaño Codirector Ing. Marco Taipe

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