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PROYECTO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERÍA DESARROLLO DE MÉTODOS QUÍMICOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y TITULACIONES EN EL LABORATORIO DE.

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1 PROYECTO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERÍA DESARROLLO DE MÉTODOS QUÍMICOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y TITULACIONES EN EL LABORATORIO DE MEDIO AMBIENTE AUTOR: ALEXANDRA MAGALY LAMIÑA LUGUAÑA Sangolquí – Ecuador. Junio, 2011

2 DESARROLLO DE MÉTODOS QUÍMICOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y TITULACIONES EN EL LABORATORIO DE MEDIO AMBIENTE CONTENIDO DEL PROYECTO DE TESIS INTRODUCCIÓN CONDICIONES Y ALCANCES Validación de Métodos Analíticos Parámetros químicos METODOLOGÍA Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN DISCUSIÓN DE RESULTADOS CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES INTRODUCCIÓN CONDICIONES Y ALCANCES Validación de Métodos Analíticos Parámetros químicos METODOLOGÍA Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN DISCUSIÓN DE RESULTADOS CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

3 Validación de Métodos Analíticos en el marco de la Acreditación de Laboratorios según la Norma ISO/IEC INTRODUCCIÓN Comprobar hipótesis de un método analítico, asegurando apto rendimiento en su aplicación.

4 MARCO TEÓRICO: Validación de Métodos Analíticos Condiciones y alcance de la Validación Veracidad Selectividad Linealidad Límite de detección Límite de cuantificación Robustez Precisión (repetibilidad y/o reproducibilidad) Exactitud Incertidumbre Intervalo de trabajo Gráficos de control Rango de trabajo y linealidad Límites de detección y cuantificación Precisión: repetibilidad y reproducibilidad Incertidumbre Exactitud Selección a juicio profesional CASO 1: MÉTODOS NORMALIZADOS CASO 2: MÉTODOS MODIFICADOS CASO 3: MÉTODOS INTERNOS

5 VALIDACIÓN DE PARÁMETROS QUÍMICOS Métodos de Análisis Químicos Métodos de Análisis Químicos Método de análisis óptico. El espectrofotómetro compara la radiación absorbida por una solución de concentración desconocida ( nm) Método de análisis químico volumétrico cuantitativo -> titulante de Vol. y Conc. conocida reacciona con una solución de Conc. desconocida. Sol. Concentración desconocida coloreada

6 Métodos Químicos Validados ALCALINIDADTitulación: HCL y H 2 SO 4 0,02N 50 – 1000mg/L CaCO 3 CLORUROSTitulación: AgNO 3 0,1414N mg/L de Cl - Agua natural, agua residual (excretas humanas y de organismos superiores). Los mares y los océanos, aguas subterráneas. DUREZATitulación: EDTA 0,1M mg/L CaCO 3 Aguas subterráneas (contacto con el suelo y las formaciones rocosas) FLUORUROSEspectrofotometría Método SPANDS 0.02 a 2mg/L de F - Compuestos fluorados por la industria. Aguas potables -> prevención de caries dental NITRÓGENO AMONIACAL Espectrofotometría Método NESSLER 0,05 a 2,5mg/L de NH 3 –N Aguas residuales con degradación de materia orgánica. Su presencia = prueba contaminación reciente SULFUROSEspectrofotometría Método AZUL DE METILENO 5 a 800 ug/L de S 2- Agua subterránea y termales, emanaciones gaseosas volcánicas NITRITOSEspectrofotometría Método GREISS 0,01 a 0,3mg/L de NO 2 -N Aguas contaminadas de naturaleza fecal CROMO HEXAVALENTE Espectrofotometría Método DIFENILCARBÁCIDA 0,05 a 0,7 mg/L de Cr 6+ Existe en la naturaleza, cromita ferrosa (FeOCr 2 O 3 ), mineral de la corteza terrestre. CIANUROSEspectrofotometría Método Piridina-Pirazolona. 0,02 a 0,20 mg/L de CN - Desechos industriales y procesos de minería a cielo abierto.

7 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la concentración: Procedimiento espectrofotométrico Fluoruros Fluoruros Respuesta lineal proporcional a la lectura del analito Concentración Teórica (mg/L) ABSORBANCIA LECTURA 1 0 0,000 0,02 -0,012 0,05 -0,025 0,1 -0,046 0,2 -0,088 0,5 -0, ,434 1,5 -0, ,831

8 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la concentración: Procedimiento espectrofotométrico Fluoruros Fluoruros DIA 1DIA 2 DIA 3 Absorbancias Conc. Medida (mg/L) Absorbancia Conc. Medida (mg/L) Absorbancia Conc.Medida (mg/L) DIA 1 0,000-0,0120,001-0,0060,001-0,032 -0,0120,017-0,0080,017-0,0190,018 -0,0250,049-0,0200,048-0,0310,048 -0,0460,100-0,0390,097-0,0510,099 -0,0880,201-0,0800,203-0,0920,203 -0,2120,502-0,2010,515-0,2160,516 -0,4341,039-0,3951,015-0,4211,034 -0,6131,473-0,5731,474-0,6141,521 -0,8312,000-0,8072,078-0,7891,963 DIA 2 0,002-0,0140,001-0,0300,001-0,030 -0,0110,018-0,0180,018-0,0190,019 -0,0240,049-0,0300,048-0,0310,048 -0,0440,098-0,0500,098-0,0510,097 -0,0870,204-0,0920,203-0,0940,202 -0,2090,502-0,2140,508-0,2180,505 -0,4271,036-0,4231,032-0,4451,060 -0,6091,481-0,6291,548-0,6251,501 -0,8191,995-0,7881,946-0,8161,968 DIA 3 0,002-0,0370,001-0,0310,001-0,045 -0,0200,019-0,0190,019-0,0250,019 -0,0310,047-0,0310,048-0,0370,048 -0,0510,098-0,0510,098-0,0570,097 -0,0920,203-0,0930,202-0,1000,203 -0,2130,513-0,2150,506-0,2240,506 -0,4211,046-0,4221,020-0,4491,057 -0,6071,523-0,6471,579-0,6521,554 -0,7962,007-0,7881,929-0,8051,929

9 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la concentración: Procedimiento espectrofotométrico Fluoruros Fluoruros

10 Alcalinidad Alcalinidad Concentración Teórica (mg/L) Vol. (ml) de Solución titulante gastado No. medición 1 501,3 751,9 1002, ,1 2004, , , ,2 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la concentración: Procedimiento titulométrico Concentración Teórica (mg/L) Conc. Calculada (mg/L) No. medición , , , , , , , ,28 50mg/L CaCO 3 1,3ml de titulante Ec. Normalidad Ec. Concentración

11 Alcalinidad Alcalinidad Concentración Teórica (mg/L) DIA 1DIA 2DIA 3 Número de lecturas ,9248,00 49,9248,00 46, ,9674,8872,9674,8872,9676,8072,96 74, ,92 96,0097,9299,8496,0097,9296, ,04117,12 119,04 115,20120,96119, ,24188,16 186,24188, ,24236,16234,24 232,32236,16232,32 234, ,64468,48 464,64468,48466,56468, ,28 936,96 929,28936,96933,12935,04936,96 Concentración Teórica (mg/L) Promedio de Alcalinidad mg/L de CaCO , , , , , , , ,76 Concentraciones diarias de Alcalinidad (mg/L CaCO 3 ) DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la concentración: Procedimiento titulométrico

12 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Determinación de la curva de ajuste Alcalinidad: Linealidad Alcalinidad: Linealidad Ecuaciones de Regresión de mínimos cuadrados: RECTA DE AJUSTE: ALCALINIDAD Ec. Pendiente m Ec. Ordenada de origen b Ec. Recta de Ajuste

13 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la desviación estándar y factor de correlación en la curva de ajuste Alcalinidad Alcalinidad Ecuaciones de Regresión de mínimos cuadrados: Ec. Desv. Est. Sy Ec. Desv. Est. Sx Ec. Desv. Est. SmEc. Desv. Est. Sb Ec. Factor correlación r

14 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Limites de detección y cuantificación Alcalinidad Alcalinidad Conc mín identificada con un grado de fiabilidad. Conc menor determinada con un aceptable nivel de repetibilidad y exactitud Ec. Lím. Detección Ec. Lim. Cuantificación

15 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Precisión Reproducibilidad y Repetibilidad Reproducibilidad S R y Repetibilidad S r Comparar: 2 medias o 2 varianzas -> si difieren estadísticamente o no. Determina 2 fuentes variaciones independientes: dentro y entre grupos Precisión -> iguales condiciones de operación, mismo analista, misma muestra homogénea y en el mismo equipo. Precisión de un día a otro, diferentes condiciones. ANÁLISIS SIMPLE DE LA VARIANZA ORIGEN DE LA VARIANZA GRADOS DE LIBERTAD ( ) SUMAS DE DIFERENCIAS CUADRÁTICAS (SDC) DIFERENCIAS CUADRÁTICAS MEDIAS (DCM = SDC/ ) ENTRE GRUPOS (BETWEEN) 1 = 3-1=2 SDC B =3*(1,0922)= 3,28DCM B =3,28/2=1,64 DENTRO DEL GRUPO (WITHIN) 2 = 9-3=6 SDC W = Σ(6,058E-28 +7, ,4576) = 9,83 DCM W =9,83/6=1,64

16 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Precisión (repetibilidad y reproducibilidad) Alcalinidad Alcalinidad s r confirman errores sistemáticos s r = s R -> intervalo de trabajo no es amplio Conc. Referencia mg/L S r, ppm%CV r S R, ppm%CV R 50 1,112,341,122, ,431,941,431, ,281,321,281, ,811,541,811, ,910,480,910, ,430,611,460, ,920,411,920, ,790,413,790, Resultados de repetibilidad y reproducibilidad. Alcalinidad

17 MARCO TEÓRICO: Validación de Métodos Analíticos Incertidumbre en la medición Estimación unida al resultado de un ensayo que define un intervalo de valores dentro de los cuales se afirma que está el valor verdadero. La incertidumbre -> idea de la calidad del resultado La Guía ISO Incertidumbre Tipo A Valores calculados por métodos estadísticos: la media, desviación estándar, fórmulas químicas, etc. Incertidumbre Tipo B Valores calculados por medio de certificados o registros provenientes del fabricante y no pueden ser modificadas por el analista. Incertidumbre Combinada Considera las incertidumbres de tipo A (errores aleatorios) y las incertidumbres de tipo B (errores sistemáticos). Fuentes de incertidumbre Regla 1 Regla 2

18 CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE Diagrama Causa – Efecto: fuentes de incertidumbre Diagrama Causa – Efecto: fuentes de incertidumbre Reproducibilidad del método µ SR Apreciación / Resolución del instrumento Trazabilidad (exactitud) Incertidumbre preparación muestras µ C Vol. Balones aforados Vol. pipetas Concentración de la sol. madre Incertidumbre Combinada µ e(x) Incertidumbre deriva del equipo µ eD Incertidumbre Apreciación µ A / Resolución µ R

19 CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE Incertidumbre estándar del método: Incertidumbre estándar del método: µ e(x) S R = µ SR Ec. Incertidumbre estándar

20 CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE Diagrama Causa – Efecto: fuentes de incertidumbre Diagrama Causa – Efecto: fuentes de incertidumbre Reproducibilidad del método µ SR Apreciación / Resolución del instrumento Incertidumbre Apreciación µ A / Resolución µ R Incertidumbre deriva del equipo µ eD Trazabilidad (exactitud) Incertidumbre preparación muestras µ C Vol. Balones aforados Vol. pipetas Concentración de la sol. madre Incertidumbre Combinada µ e(x)

21 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la incertidumbre Incertidumbre en la preparación de las muestras Incertidumbre en la preparación de las muestras C 1 = conc. muestra C 2 = conc. sol. madre CaCO 3 = 2379,68 mg/L V 2 = volumen de aforo V 1 = ml. de solución madre de CaCO 3 Ec. Disoluciones

22 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la incertidumbre Corrección de Corrección de µC 1 y cálculo de µ e Conc. Teórica (mg/L) µC 1 (mg/L) 50 0, , , , , , , ,62 µC (mg/L) 0,04 0,07 0,09 0,12 0,18 0,22 0,41 0,81 Conc. Teórica (mg/L) µ e (mg/L) 50 1, , , , , , , ,87 Corrección de µC 1 Incertidumbre estándar µ e. Alcalinidad

23 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la incertidumbre Incertidumbre ABSOLUTA Y RELATIVA: Alcalinidad Incertidumbre ABSOLUTA Y RELATIVA: Alcalinidad Conc. Teórica (mg/L) µ expABS (mg/L) %µ expREL 50 2,24 4, ,87 3, , ,63 2, ,85 0, ,95 1, ,93 0, ,74 0,77 Define un intervalo en torno al resultado de una medición, y en el que se espera encontrar un intervalo del valor verdadero Porcentaje de distribución. Relación entre la µ expABS y la concentración de teórica. Incertidumbre absoluta y relativa. Alcalinidad

24 DATOS EXPERMIENTALES Y CÁLCULOS DE VALIDACIÓN Cálculo de la exactitud Exactitud Exactitud Compara resultados del diseño experimental con los valores teóricos, observando el grado de concordancia entre el valor obtenido y el valor esperado. Cuantificar la exactitud

25 DESARROLLO DE MÉTODOS QUÍMICOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y TITULACIONES EN EL LABORATORIO DE MEDIO AMBIENTE CONTENIDO DEL PROYECTO DE TESIS

26 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ALCALINIDAD: titulante HCl 0,02N ALCALINIDAD: titulante HCl 0,02N Incertidumbre de la masa (m) conforme ecuación (26): CUANTITATIVO CUALITATIVO DE IDENTIFICACIÓN Analito: Alcalinidad Unidades: mg/L de CaCO 3 Matriz: agua FUNCIÓN DE RESPUESTAINSTRUMENTALDEL MÉTODO m N/A 1,073 SmSm N/A 0,002 b N/A -1,860 SbSb N/A 0,778 R2R2 N/A 0,99999 Nivel: Conc. Teórica PRECISIÓN, EXACTITUD, INCERTIDUMBRE RepetibilidadReproducibilidadExactitudµ expandida SrSr %CV r SRSR %CV R %Recuper.µ (k= 2) 1: 50ppm 1,112,341,122,3296,432,24 2: 75ppm 1,431,941,431,9398,702,87 3: 100ppm 1,281,321,281,3197,492,57 4: 125ppm 1,811,541,811,5394,723,63 5: 200ppm 0,910,480,910,4893,871,85 6: 250ppm 1,430,611,460,6293,612,95 7: 500ppm 1,920,411,920,4193,483,93 8: 1000ppm 3,790,413,790,4193,387,74 Global 1,711,581,461,55100,043,08 LÍMITE DE DETECCIÓN (L.D.) 3,12 LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (L.C.) 6,35 INTERVALO DE TRABAJO VALIDADO ppm de CaCO 3 CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

27 DISCUSIÓN DE RESULTADOS DUREZA DUREZA Incertidumbre de la masa (m) conforme ecuación (26): CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

28 DISCUSIÓN DE RESULTADOS FLUORUROS FLUORUROS Incertidumbre de la masa (m) conforme ecuación (26): CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

29 DISCUSIÓN DE RESULTADOS NITRÓGENO AMONIACAL NITRÓGENO AMONIACAL Incertidumbre de la masa (m) conforme ecuación (26): CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

30 DISCUSIÓN DE RESULTADOS CROMO HEXAVALENTE CROMO HEXAVALENTE Incertidumbre de la masa (m) conforme ecuación (26): CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

31 DISCUSIÓN DE RESULTADOS NITRITOS NITRITOS Incertidumbre de la masa (m) conforme ecuación (26): CUANTITATIVO CUALITATIVO DE IDENTIFICACIÓN Analito: Nitritos Unidades: mg/L de NO 2 -N Matriz: agua FUNCIÓN DE RESPUESTA INSTRUMEN TAL DEL MÉTODO m N/A 1,000 SmSm N/A 0,003 b N/A 0, SbSb N/A 0, R2R2 N/A 0, Nivel: Conc. Teórica PRECISIÓN, EXACTITUD, INCERTIDUMBRE RepetibilidadReproducibilidadExactitudµexpandida SrSr %CV r SRSR %CV R %Recuper.µ (k= 2) 1: 0,01ppm 0,00044,830,00044,5685,23 0,138 2: 0,02ppm 0,00010,320,00010,3199,51 0,003 3: 0,05ppm 0,00010,160,00010,16100,29 0,005 4: 0,1ppm 0,00040,420,00040,42100,63 0,011 5: 0,2ppm 0,00120,580,00120,58100,29 0,009 6: 0,3ppm 0,00090,390,00090,3099,81 0,002 Global 0,000629,080,000617,3097,63 0,01 LÍMITE DE DETECCIÓN (L.D.) 0,002 ppm LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (L.C.) 0,004 ppm Límites permisibles para aguas de consumo humano y uso doméstico, que únicamente requieren tratamiento convencional. 1 ppm Límites de descarga a un cuerpo de agua dulce 10 ppm INTERVALO DE TRABAJO VALIDADO0,01 – 0,3 mg/L de NO 2 -N CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

32 DISCUSIÓN DE RESULTADOS SULFUROS SULFUROS Incertidumbre de la masa (m) conforme ecuación (26): CUANTITATIVO CUALITATIVO DE IDENTIFICACIÓN Analito: sulfuros Unidades: µg/L de S 2- Matriz: agua FUNCIÓN DE RESPUESTAINSTRUMENTALDEL MÉTODO m N/A 0,998 SmSm N/A 0,001 b N/A -0,524 SbSb N/A 0,208 R2R2 N/A 0, Nivel: Conc. Teórica PRECISIÓN, EXACTITUD, INCERTIDUMBRE RepetibilidadReproducibilidadExactitudµexpandida SrSr %CV r SRSR %CV R %Recuper.µ (k= 2) 1: 5µg/L 0,5010,920,5010,1399,421,05 2: 10µg/L 0,818,690,818,5195,321,63 3: 25µg/L 1,696,761,696,72100,353,37 4: 50µg/L 1,042,131,513,01100,353,03 5: 100µg/L 2,51 2,49100,765,02 6: 250µg/L 4,031,004,031,60100,478,09 7: 500µg/L 6,260,506,261,25100,4212,59 8: 800µg/L 5,580,315,580,70100,3111,38 Global 2,804,102,864,3099,685,76 LÍMITE DE DETECCIÓN (L.D.) 0,644 µg/L LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (L.C.) 1,560 µg/L Límites de descarga al sistema de alcantarillado público 1000 µg/L Límites de descarga a un cuerpo de agua dulce o marina 500 µg/L INTERVALO DE TRABAJO VALIDADO5 – 800 µg/L de S 2- CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

33 DESARROLLO DE MÉTODOS QUÍMICOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y TITULACIONES EN EL LABORATORIO DE MEDIO AMBIENTE CONTENIDO DEL PROYECTO DE TESIS

34 DESARROLLO DE MÉTODOS QUÍMICOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y TITULACIÓN EN EL LABORATORIO DE MEDIO AMBIENTE CONCLUSIONES CONCLUSIONES Los 8 métodos de ensayo se encuentran bajo los límites máximos permisibles para su aplicación en aguas limpias y residuales señalados en la legislación nacional. A excepción del cromo hexavalente, debido a que su LC permite un análisis solamente en aguas residuales. Los (%CV r ) y (%CV R ), cumplen con el criterio de aceptación: la repetibilidad debe ser igual o menor al 3%, la reproduciblidad es de 2veces la repetibilidad ; por tanto, estos métodos son precisos bajo las condiciones de trabajo establecidas. Por otro lado, los %CV correspondientes al nitrógeno amoniacal, sulfuros y nitritos; exceden el 3% de aceptación de repetibilidad pero cumplen con la condición de reproducibilidad. No obstante, estos métodos son válidos, porque esta variación sólo ocurre a muy bajas concentraciones del analito, y se debe a la poca sensibilidad de los reactivos colorimétricos a dichas concentraciones. LD y LC Los resultados de exactitud (%R); cumplen con el criterio: 100%±4*S, donde S es la mayor desviación estándar de la precisión del método, S=%CV r =3% max, lo que implica que se encuentran dentro del porcentaje aceptable; es decir, estos métodos son considerados exactos en las condiciones de trabajo empleadas para este estudio. Se comprobó la linealidad de cada método, obteniendo un coeficiente de determinación mayor a

35 DESARROLLO DE MÉTODOS QUÍMICOS POR ESPECTROFOTOMETRÍA Y TITULACIÓN EN EL LABORATORIO DE MEDIO AMBIENTE RECOMENDACIONES RECOMENDACIONES El proceso de validación de los métodos químicos, es un proceso complejo que requiere del conocimiento detallado de los métodos químicos de medición. Así mismo, se debe disponer de información estadística de los datos que se obtienen en forma rutinaria en el laboratorio, por lo cual se recomienda realizar previamente estudios de validación de métodos, materiales y equipos. La validez e importancia de la información del laboratorio, particularmente las referidas a procedimientos de validación involucran complejos procesos de análisis, por consiguiente se recomienda el diseño e implementación de un software para el procesamiento, registro, generación de informes, almacenamiento y recuperación de los datos de ensayo o calibración, con la finalidad de automatizar los procesos de validación y facilitar el intercambio interlaboratorial de ensayos proporcionando un alto grado de confianza y calidad al sistema de acreditación. Si un nuevo analista desea producir cambios en: equipos, reactivos, instrumentación y materiales del laboratorio de trabajo para el análisis de los métodos químicos desarrollados en este trabajo, se deberá realizar un nuevo procedimiento de validación. Se recomienda siempre trabajar con reactivos de referencia actuales, disponer de los certificados de calibración de los equipos, tener los manuales de trabajo actualizados y trabajar respetando las políticas de manejo del laboratorio.

36 GRACIAS AUTOR: ALEXANDRA MAGALY LAMIÑA LUGUAÑA Sangolquí – Ecuador. Mayo, 2011


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