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CAPITULO III: HEMOGLOBINA TRANSPORTADORES DE OXIGENO En vertebrados son las proteínas hemoglobina y mioglobina.En vertebrados son las proteínas hemoglobina.

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2 CAPITULO III: HEMOGLOBINA

3 TRANSPORTADORES DE OXIGENO En vertebrados son las proteínas hemoglobina y mioglobina.En vertebrados son las proteínas hemoglobina y mioglobina. Hemoglobina (Hb) eritrocitos.Hemoglobina (Hb) eritrocitos. 3 x 10 8 moléculas de Hb por eritrocito.3 x 10 8 moléculas de Hb por eritrocito. Su función es la de transportar oxígeno en la sangre mediante el sistema circulatorio.Su función es la de transportar oxígeno en la sangre mediante el sistema circulatorio. Mioglobina (Mb) músculoMioglobina (Mb) músculo Su función es la de reservar y desplazar el oxígeno en el músculo.Su función es la de reservar y desplazar el oxígeno en el músculo.

4 EL OXÍGENO SE UNE AL GRUPO PROSTÉTICO HEMO La función de la Hb y Mb depende de la presencia del grupo hemo (unidad no polipeptídica), el cual da el color rojizo característico. Grupo prostético: unidad específica no polipeptídica que se une a muchas proteínas para cumplir su actividad biológica. Grupo prostético hemo consta de: –una parte orgánica protoporfirina: formada por 4 grupos pirrólicos unidos por puentes metino (anillo tetrapirrólico).

5 H - C - C - H H - C C - H N H Molécula de Pirrol protoporfirina IX

6 El isómero protoporfirina IX está presente en los sistemas biológicos. Fe del grupo hemo ligado a los 4 N en el centro de la protoporfirina. Fe puede formar otros dos enlaces a cada lado del grupo hemo (quinta y sexta posición de coordinación). 1 N N 2 Fe5Fe 6 4 N N 3 Plano del hemo

7 Átomo de Fe estado de oxidación: –(+2) ferroso, en hemoglobina ferrohemoglobina (capta oxígeno). –(+3) férrico, en hemoglobina ferrihemoglobina

8 LA CRISTALOGRAFÍA POR RAYOS X REVELA LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL CON DETALLE ATÓMICO 1957 John Kendrew y Max Perutz descubrieron la estructura tridimensional de la Hb y la Mb respectivamente. La microscopía electrónica revela estructura de macromoléculas biológicas pero sin detalle atómico. La cristalografía de rayos X revela la estructura tridimensional de muchos de los átomos en una proteína

9 Experimento Adición Varios dias (NH 4 ) 2 SO 4 Mioglobina en una Mioglobina en Cristales de solución tampón diluida (NH 4 ) 2 SO 4, 3M, pH 7 mioglobina La solubilidad de la mayoría de proteínas se reduce por adición lenta de concentraciones altas de cualquier sal (salting out o precipitación por salado).

10 Los tres componentes en cristalografía por rayos X son: –Fuente de rayos X –Cristal de proteína –Detector haces difractados haz de rayos x Cristal Detector (ie: película) Se produce un haz de rayos X de una longitud de onda de 154 Aº Fuente de rayos X

11 Los haces dispersos se detectan por medio de una película fotográfica. Principios básicos de la técnica: Los electrones dispersan los rayos X, y a más electrones mayor es la longitud de la onda dispersada. Las ondas dispersas se recombinan. La recombinación depende del ordenamiento de los átomos

12 LA MIOGLOBINA TIENE UNA ESTRUCTURA COMPACTA Y UN ALTO CONTENIDO DE HÉLICES Características: Compacta (45 x 35 x 25 Å). 75% hélice dextrógiras. Existen ocho segmentos helicoidales principales A,B,C,D,E,F,G,H. Los residuos se enumeran de acuerdo al segmento en donde se encuentren. Las regiones no helicoidales entre los segmentos toman el nombre de los segmentos contiguos.

13 Hay otras dos regiones no helicoidales: dos residuos en el extremo amino terminal (NA y NA2) y cinco residuos en el extremo carboxilo- terminal (HC HC5). Val – Leu – Ser– Glu - Gly……….Glu……….Glu – Leu – Gly – Tyr – Gln - Gly NA1 NA2 A1 A2 A3 A16 H24 HC1 HC2 HC3 HC4 HC5 Empieza con la cadena A y termina con la cadena H

14 La interrupción de los segmentos se debe a varios factores (no se conocen todos), uno importante es la presencia de un residuo de prolina (este no se puede acomodar en la hélice excepto al final), pero solo hay 4 mientras hay 8 terminaciones de hélices, indicando claramente la presencia de otros factores (Ej. el OH de la S y T interaccionan con el carbonilo de la cadena principal) COO - + H 3 N - C – H H 2 C CH 2Prolina CH 2

15 Los grupos peptídicos son planos. Carbonilo trans con respecto al NH. Los ángulos de distancia y enlace son como los de los dipéptidos. El interior y exterior están bien definidos. El interior con residuos no polares como Leu(L), Val(V), Met(M), Phe(F), sin cadenas laterales de Asp(D), Glu(E), Asn(N), Lys(K), Arg(R),Gln(Q). En residuos con partes polares y no polares comoThr(T), Tyr(Y), Trp(W) sus porciones apolares apuntan hacia el interior. Solo hay dos residuos polares en el interior, dos histidinas que tienen una función crítica en el centro activo. El exterior posee residuos polares y apolares

16 CENTRO DE UNIÓN AL OXÍGENO EN LA MIOGLOBINA El grupo hemo esta localizado en una oquedad en la molécula de mioglobina. Las cadenas de propionato del hemo están en la superficie de la molécula, el resto está en el interior rodeado de residuos apolares a excepción de las dos Hys(H). El átomo de hierro del hemo está enlazado a la histidina proximal F8 que ocupa la 5 ta posición de cordinación

17 El hierro queda unos 0.34 Å fuera del plano hacia el lado de la histidina proximal. El oxígeno se une a la sexta posición de coordinación.La histidina distal F8 no está ligada al grupo hemo.

18 Se han investigado tres formas fisiológicamente importantes de la Mb, cuya diferencia radica en la sexta posición de coordinación: en la desoximioglobina esta vacía la ferrimioglobina tiene agua la oximioglobina tienen O 2 En la oximioglobina el eje del O 2 forma un ángulo de 121° con el enlace Fe-O. El átomo de hierro se desplaza unos 0.24Å en la oxigenación.

19 Por lo tanto el grupo hemo no es una estructura rígida. En la hemoglobina esta propiedad desempeña un papel clave en su actividad fisiológica.

20 LA AFINIDAD POR EL CO DISMINUYE POR LA PRESENCIA DE LA HISTIDINA DISTAL CO es un veneno porque se combina con la ferrihemoglobina y la ferrimioglobina interfiriendo en el transporte de O 2. Un grupo hemo aislado es veces más afin al CO que al O 2,, sin embargo la afinidad de Hb y Mb tan solo es 200 veces mayor que para el O 2. Esto se explica así:

21 En los complejos CO- hierroporfirina de elevada afinidad el Fe - C - O está en línea recta O His F8 C Fe N C C N C

22 En la carboximioglobina el Fe - C toma un ángulo de 121° en el eje del CO. C N His E7 C N O H C Fe N C N - C

23 El enlace lineal de CO se dificulta por el impedimiento estéreo de la histidina distal (E7) El eje de la molécula de O 2 toma un ángulo con el enlace Fe - O tanto en la oximioglobina como en las sustancias modelo. La histidina distal (E7) obliga al CO a enlazarse en ángulo y no en recta, lo que debilita su interacción con el Fe.

24 LA HEMOGLOBINA CONSTA DE CUATRO CADENAS POLIPEPTÍDICAS Estas cadenas se mantienen unidas por interacciones no covalentes Hb tiene 4 sitios de unión para el O 2 porque cada cadena tiene un grupo hemo. Hb A (principal en los adultos) consta de : –2 cadenas ( 2, 2 ) –2 cadenas Hay una Hb minoritaria en adultos, la Hb A2 ( 2, 2 ) 25% del total.

25 El feto tiene distinta Hb –Hb embrionaria ( 2, 2 ) en forma temprana, luego se sustituye por Hb F ( 2, 2 ) La cadena es común a todas y tiene 141 aminoácidos. Las cadenas,, contienen cada una 146 aminoácidos unidos en secuencias similares. F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Cadena phe - ala - thr - Leu - Ser - Glu - Leu - His - Cys Cadena phe - Ser - Gln - Leu - Ser - Glu - Leu - His - Cys Cadena phe - Ala - Gln - Leu - Ser - Glu - Leu - His - Cys Únicas diferencias de esta secuencia de 9 aa

26 ESTRUCTURA CUATERNARIA DE LA HEMOBLOBINA La molécula de Hb es casi esférica, con un diámetro de 55Å. Las 4 cadenas empaquetadas en posición tetraédrica. Los grupos hemo están en una oquedad cerca del exterior de la molécula, una en cada subunidad. Los 4 lugares de unión al O 2 están separados. La distancia entre los átomos de Fe cercanos es 25Å. Cada cadena está en contacto con las dos cadenas Poca interacción entre - y -

27 La interacción y se sostiene por enlaces de hidrógeno. Los contactos y son menos extensos y por lo tanto más débiles.

28 LA ESTRUCTURA TERCIARIA DE LAS CADENAS y DE LA HEMOGLOBINA ES MUY SEMEJANTE A LA MIOGLOBINA Las estructuras tridimensionales de la mioglobina y de las cadenas y de la hemoglobina humana son sorprendentemente similares. Hemoglobina humana F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Cadena Leu - Ser - Ala - Leu - Ser - Asp - Leu - His - Ala Cadena phe - ala - thr - Leu - Ser - Glu - Leu - His - Cys Mioglobina del Leu - Lys - Pro - Leu - Ala - Gln - Ser - His - Ala Cachalote

29 Coinciden en 24 de las 141 posiciones por lo que secuencias distintas de aa pueden determinar estructuras tridimensionales similares La estructura denominada el doblamiento globina es común para todas las hemo y mioglobinas en vertebrados y son de gran importancia biológica. El doblamiento de la cadena polipeptídica es el diseño fundamental de la naturaleza para un portador de oxígeno y también un caracter evolutivo.

30 DIFERENCIAS FUNCIONALES ENTRE LA MIOGLOBINA Y LA HEMOGLOBINA La Hb es una proteína alostérica, mientras que la Mb no lo es. Esta diferencia queda reflejada en tres maneras: 1)La unión de O 2 a la Hb favorece nuevas adiciones de O 2 a la misma molécula de Hb. El O 2 se une a la Hb cooperativamente lo que no sucede con la Mb. 2)La afinidad de la Hb por el O 2 depende del pH, mientras que la afinidad de la Mb es independiente de él. La molécula de CO 2 también afecta a la capacidad de enlazar el O 2 por parte de la Hb.

31 La afinidad de la Hb por el O 2 se regula además por fosfatos orgánicos como el 2, 3 difosfoglicerato (DPG). Como resultado la Hb tiene menor afinidad que la Mb O O O - C – OPO 3 = C H - C - OH H - C - OPO 3 = CH2OPO 3 = DPG2,3 DPG

32 LA UNIÓN DEL OXÍGENO A LA HEMOGLOBINA ES COOPERATIVA Función de saturación, Y, como la fracción de ocupación de los centros de unión del oxígeno. Su valor oscila desde 0 hasta 1. Curva de disociación

33 La curva de disociación del oxígeno mioglobina hemoglobina Aspectos en que difieren la mioglobina y la hemoglobina 1.- PO 2 (presión parcial del oxígeno) es < para la mioglobina que para la hemoglobina. La afinidad del oxígeno parámetro denominado P 50 (presión parcial del O 2 a la cual se encuentran ocupados el 50% de los centros de unión, esto es, en la que Y = 0.5) Mioglobina P 50 = 1 Torr Hemoglobina P 50 = 26 Torr

34 2.- La curva de disociación del oxígeno: Mioglobina tiene forma hiperbólica Hemoglobina tiene forma sigmoidea En términos moleculares forma sigmoidea unión del O 2 a la hemoglobina = cooperativa.

35 La unión del O 2 al grupo hemo facilita la unión del O 2 a los otros tres grupos hemo. Curvas de disociación en términos cuantitativos: Mb O 2 Mb + O 2 La constante de equilibrio K para la disociación de la oxihemoglobina es : [Mb] [O 2 ] (1) K = [Mb O 2 ] [Mb O 2 ]= concentración oxihemoglobina [Mb ] = concentración de desoxihemoglobina [O 2 ]= concentración de oxígeno

36 La fracción de saturación Y se define como: [MbO 2 ] (2) Y = [MbO 2 ] + [Mb] Sustituyendo la ecuación 1 en la 2 resulta : [O 2 ] Y = [O 2 ] + K Puesto que el O 2 es un gas, se expresa su concentración en términos de pO 2 La ecuación 3 queda transformada en: pO 2 Y = pO 2 + P 50

37 Para realizar la curva de disociación del oxígeno en la Mb y Hb se deben reemplazar el pO 2 por valores entre 0 y 100 y el p50 por las constantes correspondientes a Mb y Hb, para obtener la saturación (Y) en las ecuaciones indicadas anterioremente, por ejemplo: Mb Hb pO 2 (pO 2 ) 4 Y = Y = pO 2 + P 50 (pO 2 ) 4 + (p50) 4 En el caso de la hemoglobina los valores en la ecuación se elevan a la cuarta potencia debido a que posee cuatro sitios de unión al O 2.

38 La ecuación se representa como una hipérbola. La curva de disociación del oxígeno, tomando P 50 como un Torr, se adapta a la curva observada exprerimentalmente para la mioglobina. Ninguna de las curvas que se obtiene con esta ecuación sería aplicable a la hemoglobina (sigmoidea). La curva de saturación del O 2 de la hemoglobina está situada entre la curva n = 1 y n = 4

39 El valor de n se incrementa con el cooperativismo. El valor máximo de n es igual al número de sitios ligando. Al unirse el O 2 a un hemo se facilitará la unión de más O 2 a los grupos hemo del mismo tetrámero de la hemoglobina e inversamente su liberación facilita la liberación de los demás O 2. Hay una comunicación entre los grupos hemo de una molécula de hemoglobina. La unión cooperativa del O 2 a la hemoglobina se denomina interacción hemo - hemo.

40 EFECTO BOHR: LOS IONES H + Y EL CO 2 PROMUEVEN LA LIBERACIÓN DE O 2 La mioglobina no manifiesta cambios en la capacidad de unión al O 2 aún con variaciones de pH en un amplio intervalo o por la presencia de CO 2. Dentro de los márgenes fisiológicos una disminución del pH cambia la curva de disociación del oxígeno reduciendo la afinidad de la hemoglobina por el O 2

41 En la hemoglobina la acidez estimula la liberación de O 2. La disminución del pH reduce la afinidad por el O 2 lo que permite su liberación.

42 A pH constante el aumento de la concentración de CO 2 disminuye la afinidad por el O 2 ; este mecanismo se da en un músculo en contracción donde se produce mucho CO 2 y H + en los capilares dando lugar a la liberación de O 2. (efecto Bohr). En los alveolos pulmonares se da el efecto recíproco donde la alta concentración de O 2 libera H + y CO 2 de la hemoglobina.

43 EFECTO BOHR O 2 Hb + H + + CO 2 En tejido En alvéolos metabolicamente pulmonares activo H + Hb + O 2 CO 2

44 El CO 2 se une a los grupos amino terminales de la hemoglobina y así reduce la afinidad por el O 2. Por cada molécula de O 2 consumida, se producen 0.8 moléculas de CO 2 que en su mayoría se transporta como bicarbonato por acción de la anhidrasa carbónica.

45 disociación CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 HCO H + anhidrasa carbónica a pH sanguíneo El H + en su mayor parte es reabsorbido por la desoxihemoglobina debido al efecto de Bohr, parte del CO 2 es transportado como carbamato por la hemoglobina.

46 EL DPG DISMINUYE LA AFINIDAD POR EL OXIGENO El 2,3 difosfoglicerato (DPG) se une a la desoxihemoglobina y tiene un efecto importante en la afinidad por el O 2. El DPG se encuentra presente en los hematíes humanos y de otras especies a la misma concentración molar que la hemoglobina.

47 En ausencia del DPG la presión parcial de la hemoglobina es de 1 Torr, igual a la de la mioglobina. En presencia del DPG, el P 50 llega a 26 Torrs. El DPG reduce 26 veces la afinidad por el O 2.

48 Un DPG se une por cada tetrámero de hemoglobina. El DPG está cargado negativamente. El DPG se une sobre el eje de simetría de la molécula de hemoglobina, en la cavidad central. Su punto de enlace se constituye de los siguientes residuos (positivamente cargados) de las dos cadenas : el grupo -amino, la lisina EFG y la histidina H21.

49 El DPG en la hemoglobina fetal se enlaza débilmente debido a que el residuo H21 no es histidina sino serina, por lo que la hemoglobina fetal no libera con tanta facilidad el O 2 debido a que tiene mayor afinidad. En la oxigenación el DPG es expulsado debido a que la cavidad central se hace muy pequeña; disminuye el espacio entre las hélices H de las cadenas, la distancia entre los grupos -amino aumenta 4 Å y no pueden hacer contacto con los fosfatos del DPG.


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