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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Iztacala Metodología Científica III Cruz Olmos Sandra Llamas Franco Yago S. Maldonado.

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1 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Iztacala Metodología Científica III Cruz Olmos Sandra Llamas Franco Yago S. Maldonado González Gabriel M. Noriega Hidalgo Roberto D. Verdín Flores Jessica S. Villegas Macedo Angélica Y. Evaluación de la absorción de metales pesados por fitorremediación en aguas residuales utilizando Amaranthus hybridus mediante un sistema de humedal.

2 AGUAS RESIDUALES Cuerpos de agua contaminados por heces fecales, orina y subproductos de la actividad humana ORGÁNICOS INORGÁNICOS N, P, cloruros, carbonatos, sulfuros y metales pesados (Fe, Cd, Cr, Cu, Hg o Zn) 99.9% de agua y un 0.1% de sólidos Tóxicos o venenosos Componentes Carcinógenos Estrés oxidativo Tóxicos o venenosos Componentes Carcinógenos Estrés oxidativo

3 ESTRÉS OXIDATIVO Efecto tóxico por especies químicas altamente reactivas producidas durante la reducción del oxígeno molecular en los organismos aerobios, que pueden ser o no radicales libres Causa: inactivación de enzimas blanqueo de pigmentos peroxidación de lípidos degradación de proteínas Causa: inactivación de enzimas blanqueo de pigmentos peroxidación de lípidos degradación de proteínas

4 USO DEL AGUA En México, una de las grandes problemáticas es la disponibilidad y contaminación y demanda en los usos del agua. Tratamiento de aguas residuales Los costos elevados, tratamiento y conducción al lugar de rehúso Alternativa factible: FITOREMEDIACIÓN En México, una de las grandes problemáticas es la disponibilidad y contaminación y demanda en los usos del agua. Tratamiento de aguas residuales Los costos elevados, tratamiento y conducción al lugar de rehúso Alternativa factible: FITOREMEDIACIÓN

5 Plantas como filtros biológicos Plantas como filtros biológicos Remover Transferir Estabilizar Concentrar Destruir los contaminantes Remover Transferir Estabilizar Concentrar Destruir los contaminantes Fijándolos a Raíces Tallos Rizofiltración Fitoextracción Hiperacumuladoras de MP Suelo Agua (utilizando humedales) Suelo Agua (utilizando humedales)

6 Actualmente se conocen 400 especies repartidas en 45 familias, siendo la familia Brassicaceae y Fabaceae las que cuentan con más especies hiperacumuladoras. Helianthus annuus es capaz de absorber grandes cantidades de uranio del suelo. Arabidopsis thaliana es capaz de acumular cobre y zinc en grandes cantidades. Amaranthus retroflexus es capaz de acumular cesio 137, el cual es radiactivo y muy peligroso.

7 Es una especie de la familia de las Amaranthaceae, originaria de México la cual está considerada como una maleza de follaje comestible. Esta planta es altamente competitiva, presentando como rasgo más llamativo el ser hiperacumuladora.

8 Humedales artificiales

9 ANTECEDENTES

10 GENERAL Evaluar la absorción de metales pesados en Amaranthus hybridus. PARTICULARES Cuantificar la absorción de plomo y cadmio en raíz y parte aérea. Evaluar el estrés oxidativo causado por las aguas residuales en Amaranthus hybridus. Evaluar la calidad del agua residual por tratamiento con humedales GENERAL Evaluar la absorción de metales pesados en Amaranthus hybridus. PARTICULARES Cuantificar la absorción de plomo y cadmio en raíz y parte aérea. Evaluar el estrés oxidativo causado por las aguas residuales en Amaranthus hybridus. Evaluar la calidad del agua residual por tratamiento con humedales

11 Se medirá la aptitud para transmitir la corriente eléctrica por medio de un conductímetro. Se determinará el pH utilizando un pH-metro con soluciones buffer de pH 4.00 y 7.00 para calibrarlo. El residuo seco se determinará mediante la evaporación de 100ml de agua residual en estufa a 105°C. Los metales pesados se determinaran por espectrofotometría de absorción atómica.

12 Botella de 500 ml llena Se añadirá 0.1 ml de solución MnSO4 y 0.5 ml de solución azida- iodo. Se agitara, posteriormente se agregara 0.5 ml de H2SO4 concentrado Se valorará con tiosulfato 0.01M (color paja pálido) Se añadirá gotas de solución de almidón (color azul)

13 Se realizará por la técnica de DBO de 5 días, que consiste en llenar un frasco con muestra cerrado a temperatura establecida por 5 días. Al inicio y al final de la prueba se medirá el OD. La DBO se determina mediante la diferencia entre el OD inicial y el final.

14 Amaranthus spp se obtendrá de los invernaderos de Xochimilco Se trasplantarán en un humedal de flujo horizontal Adaptación de 15 días Se dividirán en 3 grupos Grupo tratado con agua potable + solución nutricional Grupo tratado con aguas residuales Grupo tratado con agua potable + altas [ ] de Cd y Pb

15 Se digerirá con una mezcla HCl: HNO3: HClO4 (5:3:2). Se cuantificaran los metales pesados por la técnica de Espectrofotometría de absorción atómica. Parte subterránea Parte aérea

16 Cuantificación de clorofilas y Carotenoides Homogeneizado 0,1 g de peso fresco de la planta en 10 ml de acetona al 80% por 2 min en oscuridad. Se centrifugara a 3000 rpm durante 15 minutos en tubos protegidos de la luz. 0,2 ml del sobrenadante + 2 ml de acetona al 80% y se agitara. Medición absorbancia a 663 (Ch a), 646 (Ch b) y 470 nm (carotenoides), empleándose como blanco la acetona al 80% La concentración de clorofilas : fórmulas de Lichtenthaler para acetona al 80%. La concentración de clorofilas : fórmulas de Lichtenthaler para acetona al 80%.

17 500 mg de hoja Homogeneizar en frío TCA 0.1% Homogeneizar en frío TCA 0.1% centrifugar 1000 rpm por 15 min y Tomar 0.5 sobrenadante añadirle 0.5 buffer fosfatos 10mM pH 7.0 y 1mL de KI 0.5 buffer fosfatos 10mM pH 7.0 y 1mL de KI posteriormente Medir absorbancia a 390 nm. Por último Realizar cálculos con Curva estándar Realizar cálculos con Curva estándar

18 Extracción enzimática Macerar 0.1 g con 2mL de un buffer de fosfatos 50mM pH mM de EDTA y 1% de PVPP posteriormente Se centrifugará a 10,000 rpm por 20 min.

19 20 μL Extracto crudo y 200 µL mezcla de reactivos (440µL guaiacol 0.05% y 10mM H 2 O 2) Se incubara durante 10 minutos Temperatura ambiente posteriormente Se medirá absorbancia a 450 nm

20 Extracción enzimática Utilizaran 0.5 g. de hojas con 5 ml. de buffer fosfatos con pH7 y 50mg. de polivinilpirridiona luego Macerar a 4°C posteriormente Se centrifugará a 11,000 rpm por 11 min. Por ultimo Se tomará el sobrenadante

21 Se prepararan 5 ml. de la mezcla de reacción que contiene 300 µM. De buffer fosfatos con pH µM H2O2 también Se agregara 1 ml. de la enzima diluido 1:20 (v/v) Por ultimo posteriormente Se incubara a por 1min. A temperatura constante a 25°C para Detener la reacción se agregara 10 ml de H2SO4 al 2 % (v/v) para Titular el H2O2 Fue con Una solución de KMnO4 (0.2 M) hasta Obtener una coloración purpura que dure al menos 15 s.

22 Cuantificación de carbohidratos Preparación de las muestras: Se recolectarán muestras de los humedales antes de iniciar el tratamiento, durante la segunda semana, y al finalizar el tratamiento. 1g de hojas y 1g de raíz 10 ml de etanol al 80% Ebullir por 10 minutos Aforar a 10 ml

23 Azúcares reductores por el método de Nelson Somogy Patrón de glucosa 200µg/ml (ml) Agua destilada (ml) Reactivo de cobre (ml) Se calentará en baño maría 20 minutos. Se dejará enfriar. Arsenomolibdato (ml) Se ajustara el volumen a 10 ml con agua destilada Se mezclará por inversión Absorbancia a 540 nm

24 Cuantificación de almidón por método de Antrona Patrón de almidón (10mg/100ml) Filtrado de Ácido perclórico Agua destilada Antrona2.5 Se agitará por inversión. Se calentará en baño maría por 11 minutos. Se enfriará en hielo y se leerá la absorbancia a 630 nm

25 Azucares totales por el método de Antrona Patrón de glucosa (200µg/ml) Extracto problema Agua destilada Antrona2.5 Se agitará por inversión Se calentará en baño maría por 110minutos Se leerá la absorbancia a 630 nm.

26 Cuantificación de fitoquelatinas 5 g de la muestra se macerará y se lavará con 150ml solución EDTA/Pb en relación molar 12. Se cuantificarán las fitoquelatinas y metalotioninas por la técnica de espectrofotómetría de absorción atómica. Posteriormente se digerirán a 150° C por 60 minutos hasta la desaparición de vapores pardos. Reposarán con 10 ml de HNO 3 por una noche.

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