Avances moleculares aplicados a la clínica Dr. Denis Landaverde Recinos Oncólogo Médico Msc. Genética y Biología Molecular.

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1 Avances moleculares aplicados a la clínica Dr. Denis Landaverde Recinos Oncólogo Médico Msc. Genética y Biología Molecular

2 Métodos Diagnóstico Moleculares PCR PCR RT-QPCR RT-QPCR FISH FISH Microarreglos Microarreglos Bioinformática Bioinformática

3 Dogma Central de la Biología Molecular

4 AGUUAGCUAGC ADN ARN Transcripción TCATCGATCGA

5 TCAATCGATCG AGUUAGCUAGC ADN ARNm Met UA 1 CAU 2 Ile C Traducción mensajero ARNt transfer Ribosoma

6 UAGCUAGC ADN ARNm ARNt MetIle AU 2 CU 3 Asp GA TCAATCGATCG AGU

7 ATCGATCG UAGCUAGC ADN ARNm Proteína MetIleAsp TCA AGU

8 ATCGATCG U A G C U A G C ADN ARNm Degradación TCA A G U Juang RH (2004) BCbasics

9 ADN ADN es reemplazado por el ARN volviéndose el principal material genético ARN permite la biosíntesis protéica Versión final del mecanismo genético celular ProcariotaEucariota proteinas cap 5 3 cola ARNm maduro ADN 5 3 proceso ARNm ribosoma ARNm proteinas Juang RH (2004) BCbasics

10 PCR

11 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA. PCR amplificación DNA (molecule sencilla) Muchas moleculas

12 Síntesis por DNA polimerasa Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * ACG-T-T Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada 53

13 Síntesis por DNA polimerasa Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * ACGT-T-T Reacción en cadena de la polimerasa - PCR 53

14 Síntesis por DNA polimerasa Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * ACGT-T-TA 53 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

15 Síntesis por DNA polimerasa Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * ACGT-T-TAC Reacción en cadena de la polimerasa - PCR 53

16 Síntesis por DNA polimerasa Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * ACGT-T-TACG Reacción en cadena de la polimerasa - PCR 53

17 Síntesis por DNA polimerasa Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * ACGT-T-TACGT Reacción en cadena de la polimerasa - PCR 53

18 Síntesis por DNA polimerasa Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * -A T G C A T G C A T G C * * ACGT-T-TACGTA Reacción en cadena de la polimerasa - PCR 53

19 Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA Primer 1 Extensión de la cadena Cadena original de DNA ¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN? Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

20 Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

21 Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

22 Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1 2 1 Ahora tenemos dos copias de la molécula original Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

23 Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Fusión 95°C Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC Primer Ciclo 2 do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

24 Hay 7 componentes esenciales en el proceso standard de PCR ADN polimerasa termoestable ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (primers) Oligonucleotidos iniciadores (primers) Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) Cationes divalentes Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) Buffer (para mantener el pH) Cationes divalentes Cationes divalentes ADN molde (Templado) ADN molde (Templado)

25 RT-QPCR

26 Intrones y Exones en Células Eucariotas ARNm ADN 5 3 cap Cola Poly A exon intron ARNmaduro Procesado Transcripción Empalme promotor 3 5 En el núcleo Codón inicio Codón terminacion Al citoplasma Intron Borrado Juang RH (2004) BCbasics

27 El ADNc es transcrito en forma reversa del ARNm ARNm maduro Cola poly A 53 TTTT Retro Transcripción CCC 35 3 53 GGG ADN Polimerasa ARN hidrolisis 5 35

28 Para amplificar copias de cDNA de RNA Para amplificar copias de cDNA de RNA Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de RNA Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de RNA Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida Requiere primer antisense y un DNA polimerasa dependendinte de RNA Requiere primer antisense y un DNA polimerasa dependendinte de RNA Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa

29 RT-PCR AAAAAAAAAA-3 TTTTTTTTTT-5 Transcripción reversa PCR usando GSP+GSP1 AAAAAAAAAA-3 TTTTTTTTTT-5 mRNA (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o 1ra cadena cDNA GSP1 (sense) GSP (antisense) GSP1 GSP Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

30 Fluorescence in situ Hybridization

31 Fluorescence in situ Hybridization (FISH) FISH – es un proceso en el cual se pintan las cromosomas o porciones de los mismos con moléculas flourescentes FISH – es un proceso en el cual se pintan las cromosomas o porciones de los mismos con moléculas flourescentes

32 Fluorescence in situ Hybridization (FISH) Identifica anormalidades cromosómicas. Identifica anormalidades cromosómicas. Ayuda para el análisis de aberraciones estructurales, determinación de ploidías, mapeo de genes, etc. Ayuda para el análisis de aberraciones estructurales, determinación de ploidías, mapeo de genes, etc.

33 Fluorescence in situ Hybridization (FISH) Usado para identificar la presencia y localización de una resión de AND o ARN con preservación morfológica de preparados de cromosomas en células fijadas o secciones de tejido. Usado para identificar la presencia y localización de una resión de AND o ARN con preservación morfológica de preparados de cromosomas en células fijadas o secciones de tejido.

34 FISH Pro cedimiento Desnatur alizar los cromosomas Desnatur alizar los cromosomas Hibrida ción Hibrida ción Marcado Flourescente Marcado Flourescente Exami nar las láminas en la oscuridad. Exami nar las láminas en la oscuridad.

35 FISH Procedimiento

36 Microarreglos

37 Los Microarrays Son dispositivos miniaturizados capaces de realizar un experimento de hibridaci ó n m ú ltiple. Son dispositivos miniaturizados capaces de realizar un experimento de hibridaci ó n m ú ltiple. En la actualidad, existen microarrays que contienen secuencias de todos los genes de un organismo. En la actualidad, existen microarrays que contienen secuencias de todos los genes de un organismo. Se emplean para estudiar si existen genes comunes entre muestras, o sobre todo, para estudiar la expresi ó n de genes globalmente. Se emplean para estudiar si existen genes comunes entre muestras, o sobre todo, para estudiar la expresi ó n de genes globalmente. A continuaci ó n, veremos una imagen de un microarray. A continuaci ó n, veremos una imagen de un microarray.

38 Tamaño de un Microarray Un microarray contiene miles de puntos, cada uno correspondiente a una secuencia espec í fica para un gen, compuesta de unos 25 nucle ó tidos. Un microarray contiene miles de puntos, cada uno correspondiente a una secuencia espec í fica para un gen, compuesta de unos 25 nucle ó tidos. Sin embargo, el tama ñ o del dispositivo entero es el mismo que el de un portaobjetos normal. Sin embargo, el tama ñ o del dispositivo entero es el mismo que el de un portaobjetos normal.

39 Muestra de ADN Cada mancha contiene ADN conocido Biochip Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31 ADN complementario hibridizado Señal aparente Biochip Basado en Hibridizacion

40 A microarray analysis machine

41 An example of red, green and yellow spots.

42 Bioinformática

43 Bioinformática Definición intuitiva Conjunto de herramientas informáticas que sugieren soluciones a problemas biológicos

44 Bioinformática es la aplicación de los ordenadores y los métodos informáticos en el análisis de datos experimentales y simulación de los sistemas biológicos Bioinformática es la aplicación de los ordenadores y los métodos informáticos en el análisis de datos experimentales y simulación de los sistemas biológicos

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46 Una definición mucho más global es: Una definición mucho más global es: Bioinformática es la aplicación del desarrollo de la computación y las matemáticas que permite la administración, análisis y comprensión de datos para resolver preguntas biológicas. (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, etc. informática). Modificado de: Center for Research on Innovation and Competition (Harvey & Mc. Meekin, 2002). Bioinformática es la aplicación del desarrollo de la computación y las matemáticas que permite la administración, análisis y comprensión de datos para resolver preguntas biológicas. (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, etc. informática). Modificado de: Center for Research on Innovation and Competition (Harvey & Mc. Meekin, 2002).

47 Bases de datos Bases de datos Existen bases de datos primarias, que contienen información directa de la secuencia, estructura o patrón de expresión de ADN o proteína, y secundarias, que contienen datos e hipótesis derivados del análisis de las bases de datos primarias, como mutaciones, relaciones evolutivas, agrupación por familias o funciones, implicación en enfermedades, etc. Existen bases de datos primarias, que contienen información directa de la secuencia, estructura o patrón de expresión de ADN o proteína, y secundarias, que contienen datos e hipótesis derivados del análisis de las bases de datos primarias, como mutaciones, relaciones evolutivas, agrupación por familias o funciones, implicación en enfermedades, etc.ADNproteínaADNproteína

48 De nucleótidos nucleótidos La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible acceder a casi toda la información de secuencias de ADN desde cualquiera de sus tres sedes: La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible acceder a casi toda la información de secuencias de ADN desde cualquiera de sus tres sedes:ADN EMBL-BANK en el Instituto europeo de Bioinformática (EBI) EMBL-BANK en el Instituto europeo de Bioinformática (EBI) EMBL-BANKEBI EMBL-BANKEBI Enlace externo: EMBL-BANK Enlace externo: EMBL-BANKEMBL-BANK DNA Data Bank of Japan (DDBJ) en el Centro de Información Biológica (CIB) DNA Data Bank of Japan (DDBJ) en el Centro de Información Biológica (CIB)DDBJCIBDDBJCIB Enlace externo: DDBJ Enlace externo: DDBJDDBJ GenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) GenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) GenBankNCBI GenBankNCBI Enlace externo: GenBank Entrez Nucleotide Enlace externo: GenBank Entrez NucleotideGenBank Entrez NucleotideGenBank Entrez Nucleotide Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises, existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque normalmente los europeos utilizan EMBL-BANK y los americanos GenBank. Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises, existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque normalmente los europeos utilizan EMBL-BANK y los americanos GenBank.EMBL-BANKGenBankEMBL-BANKGenBank

49 De proteínas proteínas Bases de datos de secuencias de aminoácidos. Bases de datos de secuencias de aminoácidos.aminoácidos Swissprot contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de datos. Swissprot contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de datos. Swissprot Enlace externo: Swissprot en el EBI, Swissprot en Expasy Enlace externo: Swissprot en el EBI, Swissprot en ExpasySwissprot en el EBISwissprot en ExpasySwissprot en el EBISwissprot en Expasy TrEMBL por Translation of EMBL Nucleotide Sequence Database incluye la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (EMBL-BANK) y que todavía no han podido ser anotadas en Swissprot. TrEMBL por Translation of EMBL Nucleotide Sequence Database incluye la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (EMBL-BANK) y que todavía no han podido ser anotadas en Swissprot. TrEMBLEMBL-BANKSwissprot TrEMBLEMBL-BANKSwissprot Enlace externo: TrEMBL Enlace externo: TrEMBLTrEMBL PIR por Protein Information Resource está dividida en cuatro sub-bases que tienen un nivel de anotación decreciente. PIR por Protein Information Resource está dividida en cuatro sub-bases que tienen un nivel de anotación decreciente. PIR Enlace externo: PIR Enlace externo: PIRPIR ENZYME enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las secuencias de Swissprot. ENZYME enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las secuencias de Swissprot. ENZYME Swissprot ENZYME Swissprot Enlace externo: ENZYME Enlace externo: ENZYMEENZYME PROSITE contiene información sobre la estructura secundaria de proteínas, familias, dominios, etc. PROSITE contiene información sobre la estructura secundaria de proteínas, familias, dominios, etc. PROSITE Enlace externo: PROSITE Enlace externo: PROSITEPROSITE INTERPRO integra la información de diversas bases de datos de estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras bases de datos e información más extensa. INTERPRO integra la información de diversas bases de datos de estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras bases de datos e información más extensa. INTERPRO PROSITE INTERPRO PROSITE Enlace externo: INTERPRO Enlace externo: INTERPROINTERPRO PDB por Protein Data Bank es la base de datos de estructura terciaria 3-D de proteínas que han sido cristalizadas. PDB por Protein Data Bank es la base de datos de estructura terciaria 3-D de proteínas que han sido cristalizadas. PDB Enlace externo: PDB Enlace externo: PDBPDB

50 COX-2 ADA XOFKBP

51 De genomas De genomasgenomas Ensembl integra genomas eucariotas grandes, por el momemto contiene genoma humano, ratón, rata, fugu, zebrafish, mosquito, Drosophila, C. elegans, y C. briggsae. Ensembl integra genomas eucariotas grandes, por el momemto contiene genoma humano, ratón, rata, fugu, zebrafish, mosquito, Drosophila, C. elegans, y C. briggsae. Ensembl Enlace externo: Ensembl Enlace externo: EnsemblEnsembl Genomes server y TIGR son portales con información o enlaces de todos los genomas secuenciados por el momento, desde virus a humanos. Genomes server y TIGR son portales con información o enlaces de todos los genomas secuenciados por el momento, desde virus a humanos. Genomes serverTIGR Genomes serverTIGR Enlace externo: Genome Server Enlace externo: Genome ServerGenome ServerGenome Server Enlace externo: TIGR Enlace externo: TIGRTIGR Wormbase es el portal del genoma de gusano C. elegans. Wormbase es el portal del genoma de gusano C. elegans. Wormbase Enlace externo: Wormbase Enlace externo: WormbaseWormbase Flybase es el portal de la mosca del vinagre Drosophila melanogaster. Flybase es el portal de la mosca del vinagre Drosophila melanogaster. FlybaseDrosophila melanogaster FlybaseDrosophila melanogaster Enlace externo: Flybase Enlace externo: FlybaseFlybase

52 FEBRUARY 2001: Consorcio Público Celera Genomics NOVIEMBRE 2001 : Ohio State University

53 Secuencia DNA Secuencia Proteína Estructura 3DReconocimiento Molecular Identificación genes Comparación de secuencias Predicción funcional, 3D Mecánica clásica Dinámica Molecular Docking

54 Para recordar La bioinformática sugiere soluciones. La comprobación experimental es necesaria. La bioinformática sugiere soluciones. La comprobación experimental es necesaria. La bioinformática puede ahorrar trabajo, comprobando teorías in silico La bioinformática puede ahorrar trabajo, comprobando teorías in silico La bioinformática permite hacer experimentos imposibles. La bioinformática permite hacer experimentos imposibles.

55 Aplicación en Oncología PCR: p53, cmyc, PTEN, PCR: p53, cmyc, PTEN, QPCR: LMC, LLA QPCR: LMC, LLA Secuenciación: búsqueda de mutaciones Genes BRCA1 y BRCA2 Secuenciación: búsqueda de mutaciones Genes BRCA1 y BRCA2 FISH: Her2, Myc, EGFR, P53 FISH: Her2, Myc, EGFR, P53 Microarreglos: Mamaprint aprobado por FDA Microarreglos: Mamaprint aprobado por FDA

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57 Sigamos adelante….. Gracias

58 Bibliografía www.agendia.com www.agendia.com www.agendia.com ASCO Educational Book ISSN 15488748 43rd Annual Meeting June 1-5, 2007 Chicago. ASCO Educational Book ISSN 15488748 43rd Annual Meeting June 1-5, 2007 Chicago. Molecular Biology of The Cell, Albert et al, Fourth edition. 2002. Garland Science Molecular Biology of The Cell, Albert et al, Fourth edition. 2002. Garland Science Molecular and Cellular Biology. Lodish et al. 5th Whfreeman. 2005. Molecular and Cellular Biology. Lodish et al. 5th Whfreeman. 2005. Genomics, Proteomics, Bioinformatics, Discovering. A Malcolm et al, 2dn Ed. 2007 Genomics, Proteomics, Bioinformatics, Discovering. A Malcolm et al, 2dn Ed. 2007